【摘要】：植物激素及活性氧在植物體整個(gè)生命周期中發(fā)揮著非常重要的生理功能，調(diào)控植株從種子發(fā)芽、生長(zhǎng)、開(kāi)花結(jié)果直至衰老死亡的全過(guò)程。植物激素在植物體內(nèi)含量極微，且其含量與組成在時(shí)間和空間上都具有高度的動(dòng)態(tài)性，因此在植物在體、組織微區(qū)以及單個(gè)植物細(xì)胞水平上建立植物激素原位、實(shí)時(shí)探測(cè)方法，對(duì)于植物激素含量及其分布的準(zhǔn)確測(cè)定具有重要意義，可為植物激素功能、代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控研究提供有效手段?；诔㈦姌O的電化學(xué)方法因其快速、靈敏、高時(shí)空分辨等特點(diǎn)，在單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞信號(hào)分子實(shí)時(shí)原位探測(cè)以及胞吐機(jī)制研究等領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展。然而超微電極電化學(xué)用于單個(gè)植物細(xì)胞植物激素的實(shí)時(shí)探測(cè)尚未取得突破，其中發(fā)展用于植物激素高靈敏檢測(cè)的新型電化學(xué)傳感器則是實(shí)現(xiàn)該突破的基礎(chǔ)。近年來(lái)，納米材料因具有比表面積大、表面自由能高、電子傳質(zhì)速率快等特點(diǎn)，在提高電化學(xué)檢測(cè)靈敏度、選擇性、穩(wěn)定性等方面優(yōu)勢(shì)顯著，在高性能電化學(xué)傳感器構(gòu)建方面發(fā)揮了重要作用。基于植物激素實(shí)時(shí)原位探測(cè)的迫切需求以及納米材料在電化學(xué)傳感器構(gòu)建方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，本文采用金屬納米顆粒、納米線(xiàn)、石墨烯及其復(fù)合納米材料，通過(guò)在超微電極表面構(gòu)建高性能電化學(xué)傳感器，建立了單細(xì)胞水平植物激素實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方法，并在此基礎(chǔ)上對(duì)活性氧爆發(fā)以及生長(zhǎng)素胞吐外流的機(jī)制進(jìn)行了初步探索。

主要內(nèi)容如下：

1.以碳纖維微盤(pán)電極(CFMDE)為基底電極，利用Nafion的模板效應(yīng)，采用電化學(xué)沉積研制了納米鉑顆粒修飾的NPt/Nafion/CFMDE;同時(shí)采用基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的軟光刻技術(shù)，制備了一種高效固定植物懸浮細(xì)胞的瓊脂糖陣列微孔芯片。使用NPt/Nafion/CFMDE實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)單個(gè)擬南芥原生質(zhì)體活性氧爆發(fā)，并證明電化學(xué)監(jiān)測(cè)活性氧的主要成份為過(guò)氧化氫。在此基礎(chǔ)上，采用淺層培養(yǎng)法培養(yǎng)原生質(zhì)體，再生了植物細(xì)胞壁。實(shí)時(shí)電化學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，與單個(gè)原生質(zhì)體相比，植物細(xì)胞在受到苯并噻二唑刺激時(shí)，釋放的過(guò)氧化氫量顯著降低；然而當(dāng)采用過(guò)氧化物酶抑制劑抑制植物細(xì)胞壁上過(guò)氧化物酶活性后，植物細(xì)胞釋放過(guò)氧化氫量顯著回升。結(jié)果表明，細(xì)胞壁在活性氧爆發(fā)過(guò)程具有很好的調(diào)控功能，這種過(guò)氧化物酶參與的調(diào)控可在一定程度上保護(hù)植物組織免受高濃度活性氧傷害。

2.以鈦合金絲(Ti6Al4V)為基底材料，制作了碳包碳化鈦納米線(xiàn)陣歹(C/TiC NWA)微電極，并以此為基底電極，采用化學(xué)還原法在電極表面均勻負(fù)載粒徑約為3-6nm的鉑顆粒，研制了豎直排列的TiC C/Pt核殼結(jié)構(gòu)納米纖維陣列電極(TiC C/Pt-QANFAS)。并通過(guò)使用AZ5214光刻膠絕緣并暴露尖端盤(pán)面，有效的減小了微電極的活性面積，顯著降低了信噪比，該電極對(duì)植物激素生長(zhǎng)素具有較高的檢測(cè)靈敏度，檢出限可達(dá)1nmol/L。采用該電極，首次實(shí)現(xiàn)了單個(gè)油菜單個(gè)原生質(zhì)體生長(zhǎng)素釋放的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其釋放動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明生長(zhǎng)素通過(guò)胞吐方式釋放到胞外環(huán)境中，且胞吐釋放存在全衰竭融合(Full collapse fusion，F(xiàn)CF)模式以及“kiss and run”(KR)模式。這種兼具高靈敏度和快速響應(yīng)的傳感器可望用于生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸機(jī)制研究。

3.以碳纖維盤(pán)電極為基底電極，通過(guò)恒電位法在電極表面沉積了均勻分散的金納米顆粒，構(gòu)建了NAu/CFMDE，結(jié)果表明該電極在2×10-7-7.5×104mol/L范圍內(nèi)對(duì)水楊酸測(cè)定具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)限為1.5×10。mol/L，且選擇性較好，抗壞血酸(AA)不干擾測(cè)定。該技術(shù)有望用于水楊酸誘導(dǎo)植物建立系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的機(jī)理研究中。

4.以碳纖維柱電極為基底電極，通過(guò)循環(huán)掃描伏安法在電極表面沉積石墨烯和納米鉑顆粒的復(fù)合納米材料，構(gòu)建了納米鉑顆粒/石墨烯/碳纖維盤(pán)電極(NPt/rGO/CFMCE)。與基底電極相比，NPt/rGO/CFMCE對(duì)植物激素脫落酸的的響應(yīng)靈敏度提高了約7倍，檢測(cè)限為1.5×10-9]mnol/L，。在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了玉蘭葉片中脫落酸含量測(cè)定。