背景介紹:一氧化二氮(N2O)是一種重要的臭氧消耗物質(zhì)和強(qiáng)大的溫室氣體，其效力大約是CO 2的265倍。在過去的三十年中，大氣N2O濃度以每年0.73 ppb的速度逐漸增加。盡管N2O排放主要來自農(nóng)業(yè)活動(dòng)，但應(yīng)密切監(jiān)測污水處理廠的貢獻(xiàn)N2O是在污水處理廠的生物脫氮過程中產(chǎn)生的，例如來自氨氧化、硝化器反硝化和不完全異養(yǎng)反硝化。外部添加的作為電子供體的碳源，例如乙醇、甲醇和醋酸鹽，控制著在反硝化生物反應(yīng)器中的反硝化性能和N2O排放量。盡管實(shí)際實(shí)施了異養(yǎng)反硝化細(xì)菌的外部碳供應(yīng)，但尚未系統(tǒng)地研究它們的N2O消耗動(dòng)力學(xué)和不同碳源的性能。因此，有必要進(jìn)一步探索各種碳源對作為反硝化最后一步的N2O消耗的生物動(dòng)力學(xué)的影響。本研究調(diào)查了不同有機(jī)碳源對經(jīng)典反硝化進(jìn)化枝I和進(jìn)化枝II型N2O還原細(xì)菌N2O消耗生物動(dòng)力學(xué)的影響。鑒于有機(jī)碳源的可用性是主要決定N2O消耗潛力的因素之一。研究人員假設(shè)有機(jī)電子供體可能是控制(1)N2O相關(guān)生物動(dòng)力學(xué)和(2)N2O消耗活動(dòng)的彈性的因素之一在不同的N2O還原劑中以不同的方式暴露于氧氣中，這取決于它們包含的能量代謝相關(guān)基因組。為了驗(yàn)證這些假設(shè)，研究人員使用微呼吸系統(tǒng)對N2O進(jìn)行了在線監(jiān)測，在有氧間隔和無氧間隔的缺氧條件下培養(yǎng)的微生物培養(yǎng)物中的N2O和溶解氧(DO)濃度。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

建立了用于同時(shí)監(jiān)測氧氣和N 2 O的微呼吸測量系統(tǒng)，以檢查不同有機(jī)碳源對N2O還原菌生物動(dòng)力學(xué)的影響。細(xì)胞培養(yǎng)物在可容納兩個(gè)微電極和攪拌棒（Unisense）的H型瓶（有效體積為10 mL）中孵育。每種細(xì)菌進(jìn)行五批測試，每批測試都有不同的碳源，即乙酸鹽、琥珀酸鹽、甘油、甲醇或乙醇。在每批試驗(yàn)開始時(shí)，將10 mL細(xì)胞懸液移入的H形微呼吸小瓶，微呼吸瓶中裝有氧氣和N2O微呼吸電極（Unisense，Aarhus，Denmark），在小瓶中沒有頂部空間。隨后，將20μL的濃縮N 2 O溶液（25°C下為24 mM）注入小瓶中，以達(dá)到大約50μmol L-1的初始N2O濃度。如下添加碳源和電子源：乙酸鹽（320μmol L-1）、甲醇（420μmol L-1）、乙醇（210μmol L-1）、甘油（180μmol L-1）或琥珀酸酯（180μmol L-1)。過量添加有機(jī)化合物以確保N2O還原活性不受電子供體短缺的限制。微呼吸系統(tǒng)在保持在30±0.2°C的水浴中運(yùn)行，以便與之前在相同溫度下進(jìn)行的結(jié)果進(jìn)行比較，并以500 rpm的速度攪拌。使用Sensor Trace Suite軟件(Unisense)處理N2O和氧氣測量值。DO濃度與N 2 O濃度一起監(jiān)測，因?yàn)樗怯绊慛 2 O消耗活動(dòng)的關(guān)鍵因素。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究系統(tǒng)地比較了四種N2O還原菌在5種不同碳源下的N2O消耗和N2O回收情況。當(dāng)N2O作為唯一的電子受體時(shí)，有機(jī)碳源顯著影響了異養(yǎng)型N2O還原菌的生產(chǎn)性能、生物動(dòng)力學(xué)和生物量產(chǎn)量。在碳源中，乙酸和琥珀酸對DO和N2O的消耗率最高，且進(jìn)化支II型Azospira spI13的消耗率高于進(jìn)化支I型Ps.stuzeri和Pa.denitrificans。由好氧向缺氧過渡后的N2OR恢復(fù)力主要依賴于N2O還原菌的類型和補(bǔ)充的碳源。當(dāng)添加乙酸和琥珀酸時(shí)，II型nosZ菌的生物量比I型nosZ菌高。

圖1、微呼吸系統(tǒng)示意圖，建立了用于同時(shí)監(jiān)測DO和N 2 O的微呼吸測量系統(tǒng)，以檢查不同有機(jī)碳源對N 2 O還原菌生物動(dòng)力學(xué)的影響。

圖2、反硝化細(xì)菌（進(jìn)化枝I）、施式假單胞菌（進(jìn)化枝I）、固氮羅菌株I09（進(jìn)化枝II）和固氮羅菌株I13（進(jìn)化枝II）中N 2 O（紅色）和氧氣（藍(lán)色）濃度分布的動(dòng)態(tài)變化。使用乙酸鹽(a)、琥珀酸鹽(b)、甘油(c)、乙醇(d)和甲醇(e)作為碳源。體系中N2O注射用黑色垂直箭頭表示。圖中顯示了代表性的N 2 O和DO濃度分布。

圖3、以乙酸、琥珀酸、甘油、乙醇和甲醇為碳源對應(yīng)的反硝化細(xì)菌(clade I)、施式假單胞菌（cladeⅡ）/固氮羅菌屬I09（cladeⅡ）、固氮羅菌屬I13（cladeⅡ）的氧氣消耗率的全細(xì)胞Michaelis-Menten曲線。這些數(shù)據(jù)是從三次試驗(yàn)中獲得的。

圖4、以乙酸、琥珀酸、甘油、乙醇和甲醇為碳源對應(yīng)的反硝化細(xì)菌(clade I)、施式假單胞菌（cladeⅡ）/固氮羅菌屬I09（cladeⅡ）、固氮羅菌屬I13（cladeⅡ）的氧化亞氮的消耗率的全細(xì)胞Michaelis-Menten曲線。這些數(shù)據(jù)是從三次試驗(yàn)中獲得的。

圖5、缺氧條件下N2O還原活性的恢復(fù)。橫軸表示DO耗盡后的時(shí)間。數(shù)據(jù)點(diǎn)來自三次N2O呼吸試驗(yàn)。實(shí)線表示各碳源N2O還原恢復(fù)的線性模型，虛線表示95%置信區(qū)間。

結(jié)論與展望

利用一氧化二氮(N2O)還原細(xì)菌是減少工程系統(tǒng)的N2O足跡的一種很有前景的策略。使用優(yōu)選的有機(jī)碳源作為電子供體可加速這些細(xì)菌對N2O的消耗。然而當(dāng)喂食不同的有機(jī)碳物種時(shí)，它們的N2O消耗潛力和活性仍不清楚。本論文研究人員通過研究它們的生物動(dòng)力學(xué)特性和基因組潛力，系統(tǒng)地比較了各種有機(jī)碳源對N2O還原細(xì)菌活性的影響。五種有機(jī)碳源——乙酸鹽、琥珀酸鹽、甘油、乙醇和甲醇被送入四個(gè)含有進(jìn)化枝I或進(jìn)化枝II nosZ基因的N2O還原細(xì)菌。使用Unisense微呼吸系統(tǒng)對四種N2O還原細(xì)菌菌株進(jìn)行了呼吸測定分析，確定了響應(yīng)于不同喂養(yǎng)方案的溶氧和N2O消耗生物動(dòng)力學(xué)的不同變化。不管N2O還原菌是什么，使用乙酸鹽和琥珀酸鹽都獲得了更高的N2O消耗率和更高的生物質(zhì)產(chǎn)量。通過基因組分析研究了代謝補(bǔ)充碳源的潛力，其結(jié)果證實(shí)了N2O消耗生物動(dòng)力學(xué)結(jié)果。此外，電子供體的選擇對N 2O消耗活動(dòng)在氧氣暴露后恢復(fù)。本研究的結(jié)果有助于為污水處理廠異養(yǎng)反硝化過程中產(chǎn)生和排放的N 2 O制定有效的緩解策略