研究簡介:好氧土壤細(xì)菌通過從大氣中清除分子氫（H2）來維持生存。這一關(guān)鍵過程是生物地球化學(xué)氫循環(huán)中的主要匯，支持了貧營養(yǎng)生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力。在分枝桿菌屬的M.smegmatis中，大氣H2氧化由兩種系統(tǒng)發(fā)育不同的[NiFe]-氫化酶，Huc（2a組）和Hhy（1h組）催化。然而目前尚未解決這些酶如何將從H2氧化中得到的電子傳遞到有氧呼吸鏈的問題。在這項研究工作中，研究人員使用遺傳學(xué)方法確認(rèn)了在氫化酶結(jié)構(gòu)操縱子上編碼的兩種假定鐵硫簇蛋白，HucE和HhyE，對M.smegmatis中的H2消耗是必需的。序列分析顯示，這些蛋白雖然具有同源性，但屬于不同的系統(tǒng)發(fā)育分支，并具有不同的金屬結(jié)合基序。當(dāng)編碼這些蛋白的基因被單獨刪除時，H2氧化減少，并且在組合刪除時被消除。相應(yīng)地，這些缺失菌株的生長產(chǎn)率和長期存活能力與親本菌株相比適度但顯著地降低。在生化和表型實驗中，缺乏假定鐵硫蛋白的突變菌株模擬了氫化酶結(jié)構(gòu)亞基突變株。

假設(shè)這些蛋白介導(dǎo)氫化酶的催化亞基和M.smegmatis呼吸鏈中的甲萘醌池之間的電子傳遞；然而其他角色（例如在成熟階段中）也是可能的，需要進(jìn)一步的工作來解決它們的角色。這些蛋白在大多數(shù)編碼Hhy或Huc的有機體中的保守性表明，這些蛋白是大氣H2氧化的重要決定因素。

Unisense微呼吸系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微呼吸系統(tǒng)被用來測量和分析M.smegmatis（一種分枝桿菌）在不同遺傳背景下的氫氣（H2）消耗速率。首先在含有甘油的Hartmans de Bont(HdB)最小培養(yǎng)基中培養(yǎng)M.smegmatis的野生型和衍生突變株，直到達(dá)到中期靜止相。使用Unisense H2微呼吸微傳感器電極，將其在+800 mV的電壓下極化1小時，并使用已知濃度的H2標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)。在1.1 mL的微呼吸測試瓶中，先后加入靜止相菌液培養(yǎng)物（0.9 mL，OD600=3.0）、H2飽和PBS（0.1 mL）和O2飽和PBS（0.1 mL）。使用Unisense Logger Software記錄H2濃度的變化。當(dāng)觀察到H2濃度呈線性變化時，計算20秒內(nèi)H2消耗的速率。

實驗結(jié)果

研究確認(rèn)了HucE和HhyE兩種假定的鐵硫蛋白對于M.smegmatis中H2的消耗至關(guān)重要。這些蛋白對于維持氫化酶的活性和細(xì)菌的生存能力發(fā)揮著必不可少的作用。當(dāng)HucE和HhyE基因被敲除時，觀察到H2氧化速率顯著降低，表明這兩種蛋白對于氫化酶的功能至關(guān)重要。缺乏HucE和HhyE的突變株在生長產(chǎn)率和長期存活能力上表現(xiàn)出降低，這與之前關(guān)于氫化酶結(jié)構(gòu)亞基敲除株的研究結(jié)果一致。盡管HucE和HhyE在序列上具有一定程度的相似性，但它們在功能上不具有冗余性。在單突變株中沒有觀察到對氫化酶活性的補償現(xiàn)象。HucE和HhyE在大多數(shù)編碼Hhy或Huc的有機體中是保守的，這表明這些蛋白在大氣H2氧化中可能具有普遍的重要性。HucE和HhyE可能在氫化酶催化亞基和M.smegmatis呼吸鏈的甲萘醌池之間介導(dǎo)電子傳遞的假設(shè)。

圖1、與2a組和1h[NiFe]-氫化酶相關(guān)的HucE和HhyE蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。該樹可視化了52個全長HucE和26個全長HhyE序列的代表性子集之間的進(jìn)化關(guān)系。強調(diào)了恥垢分枝桿菌編碼的蛋白質(zhì)。該樹是使用最大似然法（用部分刪除處理間隙）構(gòu)建的，用100個重復(fù)進(jìn)行引導(dǎo)，并在中點扎根。

圖2、恥垢分枝桿菌。野生型、衍生突變體和互補突變株的氫氧化。使用Unisense微呼吸H2電極通過電流分析法測量整個細(xì)胞在中期穩(wěn)定期（OD max～3.0后72小時）對H 2的吸收。(A)鐵硫蛋白野生型、單突變體和雙突變體(ΔhucE、ΔhhyE、ΔhucEΔhhyE)以及氫化酶結(jié)構(gòu)亞基單突變體和雙突變體(ΔhhyE)之間H 2氧化速率的比較hucS，ΔhhyL，ΔhucSΔhhyL)。(B)分別用hucE和hhyE的表達(dá)補充的ΔhucE和ΔhhyE菌株中的H 2氧化速率。對照包括用空載體pMV261轉(zhuǎn)化的野生型、ΔhucE和ΔhhyE菌株以及用互補載體pMV hucE和pMV hhyE轉(zhuǎn)化的野生型菌株。

圖3、恥垢分枝桿菌野生型、衍生突變株和互補突變株中的氫化酶活性染色。全細(xì)胞裂解物用于在富含H 2的氣氛中以硝基藍(lán)四唑作為人工電子受體對H 2攝取進(jìn)行酶譜染色。(A)野生型、ΔhucS、ΔhucE、ΔhucSΔhhyL、ΔhucEΔhhyE、以及互補的ΔhucE和野生型恥垢分枝桿菌（帶有空pMV261或互補載體pMV hucE）培養(yǎng)物的Huc活性染色）在早期穩(wěn)定期（OD max～3.0后24小時）收獲。(B)野生型、ΔhhyL、ΔhhyE、ΔhucSΔhhyL、ΔhucEΔhhyE和互補的ΔhhyE和野生型恥垢分枝桿菌（帶有空pMV261或互補載體pMV hhyE）培養(yǎng)物的Hhy活性染色）在中期穩(wěn)定期（OD max～3.0后72小時）收獲。

圖4、恥垢分枝桿菌。野生型和突變株的生長和存活率比較。七個菌株在補充有Tween80(LBT)的溶源肉湯中生長：鐵硫蛋白的野生型、單突變體和雙突變體(ΔhucE、ΔhhyE、ΔhucEΔhhyE)，以及氫化酶結(jié)構(gòu)亞基的單突變體和雙突變體ΔhucS，ΔhhyL，ΔhucSΔhhyL）。(A)指數(shù)期的特定生長率(μ)。(B)穩(wěn)定期后24小時的最終生長產(chǎn)量(OD max)。(C)穩(wěn)定期后21天的長期存活率(CFUmL–1)。

圖5、編碼氫化酶的微生物中HucE和HhyE蛋白的分布。(a)編碼2a組[NiFe]-氫化酶的細(xì)菌基因組中HucE蛋白的分布。(b)編碼組1h[NiFe]-氫化酶的細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中HhyE蛋白的分布?；蚪M的顏色取決于是否存在全長蛋白質(zhì)，是否存在截斷的蛋白質(zhì)，或者蛋白質(zhì)是否缺失。

結(jié)論與展望

本研究主要介紹了分枝桿菌屬（Mycobacterium）中的M.smegmatis如何通過氧化大氣中的分子氫（H2）來維持生存，這一過程對生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力和生物地球化學(xué)循環(huán)具有重要意義。研究著重于兩個關(guān)鍵的[NiFe]-氫化酶：Huc和Hhy，以及它們相關(guān)的假定鐵硫蛋白HucE和HhyE。

好氧細(xì)菌通過有氧呼吸利用大氣中的H2，這是全球氫循環(huán)中的主要過程，并且對低碳土壤生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力和生物多樣性起著支持作用。盡管已知M.smegmatis通過兩種氫化酶進(jìn)行H2氧化，但這些酶如何將電子傳遞到有氧呼吸鏈的具體機制尚不清楚。本研究通過遺傳學(xué)方法，構(gòu)建了HucE和HhyE基因的敲除突變株，以探究這些蛋白在H2消耗中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，單獨刪除這些基因或同時刪除兩者都顯著降低了H2的氧化速率，并且這種降低與氫化酶結(jié)構(gòu)亞基突變株中觀察到的減少相似。此外缺乏這些鐵硫蛋白的突變株在生長產(chǎn)率和長期存活能力上也表現(xiàn)出適度但顯著的降低。研究結(jié)果支持了HucE和HhyE在H2氧化中發(fā)揮關(guān)鍵作用的假設(shè)，并且這些蛋白可能在氫化酶催化亞基和M.smegmatis呼吸鏈的甲萘醌池之間起電子傳遞的作用。

盡管這些蛋白在序列上具有相似性，但它們在功能上不具有冗余性，因為單突變株之間沒有觀察到對氫化酶活性的補償。還同步探討了HucE和HhyE在不同細(xì)菌中的保守性和它們在進(jìn)化上的分布，表明這些蛋白在大多數(shù)編碼Hhy或Huc的有機體中是保守的，暗示它們在大氣H2氧化中的重要性。

unisense微呼吸測量技術(shù)被用于評估野生型和突變株M.smegmatis的氫化酶活性。通過測量細(xì)胞在存在氫氣時的呼吸速率，研究者可以確定氫化酶的功能狀態(tài)。通過測量氫氣消耗速率，研究者能夠間接評估不同菌株的生長產(chǎn)率和長期存活能力。這是因為氫化酶活性與細(xì)菌的生長和生存能力密切相關(guān)。unisense微呼吸測量提供了定量的數(shù)據(jù)，使得研究者能夠精確地計算氫氣消耗速率，并據(jù)此評估氫化酶活性和細(xì)菌的代謝狀態(tài)。

研究的結(jié)論強調(diào)了進(jìn)一步工作的必要性，以解析這些蛋白在氫化酶活性中的具體功能，包括它們是否直接與氫化酶相互作用，以及它們在氫化酶成熟過程中可能扮演的角色。這項研究不僅增進(jìn)了我們對分枝桿菌能量代謝的理解，揭示了鐵硫蛋白HucE和HhyE在分枝桿菌屬中H2代謝和生存中的關(guān)鍵作用，而且為開發(fā)新的微生物能源策略提供了潛在的靶點。通過對這些關(guān)鍵蛋白的功能研究，可以更好地利用細(xì)菌的代謝能力，為生物能源生產(chǎn)和環(huán)境修復(fù)提供新的途徑。