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討論
已播種的釀酒葡萄漿果的中果皮通常顯示出一種與成熟后期脫水和風(fēng)味發(fā)展相關(guān)的程序性CD（Tilbrook和Tyerman，2008年；Fuentes等人，2010年；Bonada等人，2013年b）。在這里，我們展示了漿果中果皮和[O的CD模式之間的密切相似性，其中中果皮2]剖面的中心區(qū)域具有最高的CD和最低的[O 2]。在設(shè)拉子和霞多麗中，中果皮中心的缺氧量隨著成熟和CD的進(jìn)展而增加，在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，開花后約100天基本上變得缺氧。這與無籽鮮食葡萄品種形成對比，后者的[O 2]保持在~15μmol l-1在中果皮中部(1.1 kPa)以上，仍被認(rèn)為是缺氧的（Saglio等人，1988年），其中CD不太明顯。然而，在我們的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，僅測試了三個(gè)品種，并且在具有不同水和糖動態(tài)的品種類型（葡萄酒與餐桌）存在混雜效應(yīng)（Sadras等，2008之間以及種子和無種子類型之間）。分離這些影響需要對有種子和無種子等基因系進(jìn)行比較。盡管如此，CD和[O之間的強(qiáng)相關(guān)性2]剖面、皮孔的作用、種子呼吸、乙醇發(fā)酵和CT圖像都匯聚在一起，支持我們的工作假設(shè)，即中果皮中的缺氧有助于葡萄漿果中的CD。
的最小值[O 2我們在霞多麗和設(shè)拉子漿果的果皮中測得]（接近于零）可能等于或低于的K m細(xì)胞色素c氧化酶(0.14μM)（Millar等人，1994年），并且很可能導(dǎo)致氧化磷酸化受限并轉(zhuǎn)向發(fā)酵，如在霞多麗漿果中檢測到乙醇所證明的那樣；測試其他品種的乙醇生產(chǎn)會很有趣。所有需氧生物都需要O 2才能通過氧化磷酸化有效地產(chǎn)生ATP。當(dāng)細(xì)胞從氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)酵時(shí)，在缺氧條件下產(chǎn)生較低的ATP（Ricard等，1994；Drew，1997；Geigenberger，2003）。ATP的消耗對細(xì)胞生理學(xué)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，包括能量消耗和細(xì)胞代謝的變化（Drew，1997年；Bailey-Serres和Chang，2005年）。導(dǎo)致梨褐變障礙的膜完整性喪失也與內(nèi)部缺氧和低ATP水平有關(guān)（Saquet等人，2003年；Franck等人，2007年）。
葡萄漿果線粒體在強(qiáng)加厭氧條件下的存活（基于琥珀酸氧化率）取決于品種，存活時(shí)間為1天到10天（Romieu等，1992）。這項(xiàng)工作基于碳浸漬過程，這是一種釀酒過程，其中整個(gè)漿果在壓碎前在厭氧氣氛中發(fā)酵。乙醇會改變葡萄線粒體的呼吸商并解耦氧化磷酸化（Romieu等人，1992年）。這些影響發(fā)生在>1%（體積）的乙醇中，遠(yuǎn)高于我們在霞多麗漿果中測量的濃度（0.015%）；然而，在我們的案例中，漿果中可能存在局部高濃度的乙醇。在后來的一項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)在厭氧處理前田間種植的霞多麗漿果中的ADH活性和ADH RNA已經(jīng)很高，這表明由于田間的一些壓力條件，葡萄中已經(jīng)存在缺氧情況（Tesnière等人。，1993）。我們的結(jié)果表明，這可能是漿果中果皮內(nèi)某些區(qū)域的常態(tài)，并且可能會因高溫而加?。ㄒ娤挛模?。
的內(nèi)部[O 2水果]取決于呼吸需求，以及的O 2皮膚和內(nèi)部組織擴(kuò)散特性。這些可以顯示基因型差異，就像蘋果果實(shí)的情況一樣（Ho等人，2010年）。在梨果實(shí)中，皮層的孔隙率、細(xì)胞間隙的連通性和細(xì)胞分布的差異可能解釋了栽培品種之間的差異（Ho et al.,2009）。對于梨，可以使用氣體擴(kuò)散的微觀模型將觀察到的氣體擴(kuò)散變化與組織的不規(guī)則微觀結(jié)構(gòu)相協(xié)調(diào)。通過顯微CT評估的不同蘋果栽培品種似乎也是這種情況（Mendoza等人，2007年）。對于葡萄漿果，的[O 2我們研究中]分布表明O非常低2皮膚的擴(kuò)散率，因?yàn)檎麄€(gè)皮膚發(fā)生了陡峭的梯度。蘋果皮也表現(xiàn)出非常低的O 2擴(kuò)散率，同樣在整個(gè)皮膚上有一個(gè)陡峭的濃度梯度（Ho et al.,2010）。由于亞表皮[O 2所有三個(gè)葡萄品種在成熟過程中葡萄漿果的]急劇下降，這表明中O下降，2成熟過程擴(kuò)散率這可能是由于相同的表皮和角質(zhì)層結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致漿果蒸騰作用下降(Rogiers et al.,2004)。
果皮、漿果孔隙度和花梗中皮孔特性的變化都可能導(dǎo)致內(nèi)部[O的減少2成熟過程中葡萄漿果]。果實(shí)薄壁組織可以看作是一種多孔介質(zhì)，在橢圓形鑲嵌的細(xì)胞之間分布有空氣空間（Gray等，1999；Mebatsion等，2006；Herremans等，2015）。最大[O 2在整個(gè)漿果發(fā)育過程中，有核漿果和無核漿果的中心軸區(qū)域的]表明存在連接O源的通道2攝入和中央維管束。使用不同的方法，包括用硅脂堵塞花梗皮孔或施加N 2在花梗上，我們的實(shí)驗(yàn)證明花梗皮孔是O中的主要途徑2擴(kuò)散到葡萄漿果。這對應(yīng)于從容器到漿果中心軸的顯微CT中觀察到的主要?dú)獾?。用于研究水果中空氣空間分布的微CT可以揭示影響氣體擴(kuò)散的重要特性（Mendoza等人，2010年；Herremans等人，2015年）以及內(nèi)部障礙（Lammertyn等人，2003年）。在我們的工作中，連接花梗與種子周圍室腔的空氣空間的可視化提供了[O測量峰的結(jié)構(gòu)聯(lián)系2與漿果中央血管區(qū)域周圍]中。這也證實(shí)了的潛在O 2通過花梗皮孔和通過血管網(wǎng)絡(luò)分布吸收途徑。相對較高的[O 2中央和外周維管束周圍]可能對于維持漿果中韌皮部的卸載很重要，有趣的是，即使?jié){果中出現(xiàn)嚴(yán)重的CD，維管束通常仍然具有生命力（Fuentes 2017年等人，）。，2010年）。盡管如此，我們還是觀察到在缺氧漿果中的糖濃度更高，這些漿果的皮孔被覆蓋，而它們?nèi)栽谔俾?。這種異常可能是由于缺氧導(dǎo)致水流入減少，從而導(dǎo)致糖濃度增加。缺氧與質(zhì)膜透水性降低有關(guān)(Zhang and Tyerman,1991質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIP)家族的水通道關(guān)閉引起的)(Tournaire-Roux et al.,2003)。這是由于在缺氧條件下對降低的細(xì)胞質(zhì)pH值敏感。的PIP水通道蛋白基因(預(yù)測VvPIP2;1在成熟漿果中高度表達(dá))（Choat等人，2009年）在缺氧條件下會降低水滲透（Tournaire-Roux等人，2003年），這可能解釋了對霞多麗和設(shè)拉子始終觀察到的整個(gè)漿果水導(dǎo)率下降（Tilbrook和Tyerman，2009年；Scharwies和Tyerman，2017年）。
皮孔是由產(chǎn)生的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在二次生長后取代氣孔（腐生菌Lendzian，2006）。與莖周皮相比，皮孔對氣體和水滲透的影響已經(jīng)對一些物種進(jìn)行了測量。對于Betula pendula，皮孔的存在使周皮的透水性顯著增加了26到53倍（Sch?nherr和Ziegler，1980）。漿果花梗上的皮孔是沉水分離漿果吸水的優(yōu)先位置（Becker et al.,2012）。水蒸氣和O 2有和無皮孔樹皮的滲透率表明，皮孔對O 2滲透率的增加遠(yuǎn)大于對水的滲透率，一種樹種增加了1000倍以上，但對水蒸氣的滲透率高于O 2(Groh等人，2002年）。有趣的是，Sch?nherr和Ziegler(1980)表明，隨著水蒸氣活度下降（增加蒸氣壓虧缺），透水性大大降低。如果水蒸氣活性下降也降低O 2的了葡萄漿果皮孔中滲透性，這可能會限制O 2在呼吸需求增加的情況下擴(kuò)散，即在水壓力和高溫和蒸氣壓不足的情況下。
[O的減少2在發(fā)育過程中，已播種的Chardonnay漿果在近似中心軸處]表明呼吸需求可能增加，吸收的O 2通過花梗皮孔減少，或通過中央近端的孔隙率減少軸。另一方面，紅寶石無核漿果沒有表現(xiàn)出這種減少。這表明有籽釀酒葡萄品種和無籽鮮食葡萄之間的皮孔結(jié)構(gòu)可能存在差異，或者種子本身成為顯著的O 2匯（根據(jù)下面提出的論點(diǎn)不太可能）。設(shè)拉子較低的皮孔表面積可能表明對O限制更大2與霞多麗相比，擴(kuò)散的。眾所周知，設(shè)拉子在溫暖條件下更早、更快速地增加CD（Fuentes等人，2010年；Bonada等人，2013年a）。不幸的是，，我們無法探測[O 2由于無法可視化相對于設(shè)拉子漿果中傳感器的種子位置設(shè)拉子漿果中心區(qū)域的]以與霞多麗進(jìn)行比較?；üＦた自谧屍咸褲{果“呼吸”方面的作用以及它們在不同品種之間的差異似乎被忽視了，而且在水果中似乎是獨(dú)一無二的。簇的緊密度和花梗長度也可能影響通過該通道的氣體擴(kuò)散，最終導(dǎo)致整個(gè)成熟過程中漿果內(nèi)部氧氣可用性的差異。
有籽和無籽栽培品種之間氧氣分布差異的另一個(gè)可能解釋是，種子是顯著的O 2在成熟后期匯。種子的氧氣供應(yīng)對于種子生長以及蛋白質(zhì)和油的沉積至關(guān)重要（Borisjuk和Rolletschek，2009年）。另一方面，低[O 2種子內(nèi)的]有利于低水平的ROS，從而防止細(xì)胞損傷（Simontacchi等人，1995年）。在早熟期間，有籽釀酒葡萄品種雷司令和巴斯塔多的O 2吸收量從<0.45μmol h–1每個(gè)漿果增加到每個(gè)漿果約3μmol h–1，而無核Sultana的最大O 2吸收量為1.5μmol h–1每個(gè)漿果（Harris等人，1971年）。我們觀察到，在成熟開始前后，總種子呼吸作用是整個(gè)漿果呼吸作用的一半以上。O這種高2的在外層木質(zhì)化之前，種子對需求（Cadot等人，2006年）可能會產(chǎn)生顯著的O 2在漿果內(nèi)需求，這可能會降低細(xì)胞[O 2室中的]，并可能降低[O 2]在中果皮中。然而，霞多麗的種子呼吸在成熟后期急劇下降，這是每克漿果呼吸減少的原因。在晚熟期間，[O 2種子栽培品種的中果皮中的]下降到幾乎為零。因此，較低的[O不太可能是2中果皮中]由種子的呼吸需求直接引起的。
溫度升高會促進(jìn)霞多麗和設(shè)拉子漿果的CD發(fā)生并增加CD的發(fā)生率（Bonada等，2013 a）。使用梨果實(shí)的建模方法，結(jié)果表明，溫度升高會大大增加呼吸速率，但不會影響氣體擴(kuò)散特性，從而導(dǎo)致預(yù)測的核心[O非常低2]（Ho等人，2009年）。我們對漿果中果皮[O直接測量2]剖面的與這一預(yù)測一致。我們還觀察到典型的Q 10和呼吸活化能分別為2.47和2.27，在10°C和40°C之間，Chardonnay和Shiraz漿果的整個(gè)漿果呼吸速率分別為呼吸?；罨芘c報(bào)道的相似Hertog等人。(1998)對于蘋果(52 875 J mol–1)、菊苣(67 139 J mol–1)和番茄(67 338 J mol–1)。與梨果實(shí)不同，釀酒葡萄漿果在植物上成熟，并且會變得比周圍空氣熱得多（Smart和Sinclair，1976年；Tarara等人，2008年；Caravia等人，2016年）。瞬態(tài)高溫會產(chǎn)生大量的呼吸需求和低[O 2正如我們觀察到的那樣，在中果皮的中心]。然而，隨后的在夜間或較溫和的天氣時(shí)的冷卻會降低呼吸需求和增加內(nèi)部〔O 2]如果擴(kuò)散代表O 2保持相同。這可能會導(dǎo)致產(chǎn)生破壞性的ROS，從而導(dǎo)致不可恢復(fù)的細(xì)胞損傷（Pfister-Sieber和Braendle，1994年；Ravyler等人，2002年）。
結(jié)論
葡萄內(nèi)部[O 2]在果實(shí)發(fā)育過程中下降，并且與中果皮細(xì)胞死亡的特征相關(guān)?；üＩ系钠た诪镺提供了途徑2擴(kuò)散到漿果中，當(dāng)被覆蓋以限制O 2擴(kuò)散到漿果中時(shí)，會導(dǎo)致漿果[O大量減少2中心的]，乙醇濃度增加，以及細(xì)胞死亡。不同內(nèi)部O 2品種之間漿果可用性的差異可能與種子發(fā)育和皮孔表面積的差異有關(guān)。這里提供的數(shù)據(jù)為進(jìn)一步研究漿果氣體交換在漿果質(zhì)量和栽培品種選擇中的作用提供了基礎(chǔ)，以適應(yīng)氣候變暖的葡萄栽培。
補(bǔ)充資料
補(bǔ)充數(shù)據(jù)可在JXB在線獲得。
圖S1。漿果呼吸速率的溫度依賴性。
圖S2。呼吸Q 10 Chardonnay和Shiraz漿果的在兩個(gè)成熟階段對短期測量溫度的響應(yīng)。
圖S3。兩個(gè)發(fā)育階段霞多麗漿果空氣空間的顯微CT分析。
致謝
我們感謝Wendy Sullivan的專家技術(shù)援助，以及Adelaide Microscopy的設(shè)施和技術(shù)支持。這項(xiàng)研究由澳大利亞研究委員會(ARC)創(chuàng)新葡萄酒生產(chǎn)培訓(xùn)中心(中心www.adelaide.edu.au/tc-iwp/)進(jìn)行，該作為ARC工業(yè)轉(zhuǎn)型研究計(jì)劃（項(xiàng)目編號IC130100005）得到澳大利亞葡萄酒協(xié)會和行業(yè)合作伙伴的支持。
