摘要

遠(yuǎn)洋環(huán)境中的氧氣呼吸速率通常難以量化，因?yàn)槲覀兊难鯕鉂舛葴y(cè)定方法的分辨率對(duì)于在小于24小時(shí)的瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)過程中觀察到顯著的降低是有限的。在這里，我們提出了一種新的高靈敏度方法的評(píng)估，該方法將可切換微量氧（STOX）傳感器與人工降低O2濃度的全玻璃瓶培養(yǎng)相結(jié)合。該方法的呼吸速率檢測(cè)限與O2濃度成反比，對(duì)于初始O2濃度為500 nmol L-1的水，檢測(cè)限降至<2 nmol L-1 h-1。該方法在丹麥沿海水域和海洋缺氧水域進(jìn)行了試驗(yàn)。事實(shí)證明，它還可以在低耗氧率（~7 nmol L-1 h-1）下進(jìn)行精確測(cè)量，并顯著減少培養(yǎng)所需的時(shí)間(≤14小時(shí)）與傳統(tǒng)方法相比。該方法提供連續(xù)實(shí)時(shí)測(cè)量，允許多種可能性，例如模擬氧氣減少速率以獲得動(dòng)力學(xué)參數(shù)。我們的數(shù)據(jù)顯示，海洋細(xì)菌的表觀半飽和濃度（Km值）比之前報(bào)道的低一個(gè)數(shù)量級(jí)，介于66和234 nmol L-1 O2之間。Km值在不同的浮游微生物群落中有所不同，但我們的數(shù)據(jù)表明，在0.5–1 mmol L-1 O2濃度下測(cè)量可靠的呼吸速率是可能的，與在完全空氣飽和時(shí)測(cè)量的呼吸速率相當(dāng)。

介紹

氧是生命的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，生物體的呼吸耗氧量作為多個(gè)變量的函數(shù)已被廣泛研究。然而，氧呼吸不僅在生理學(xué)方面很有趣，而且是碳的生物地球化學(xué)循環(huán)和通過任何生態(tài)系統(tǒng)的有機(jī)物質(zhì)流動(dòng)中的一個(gè)主要因素。雖然我們地球的大部分地區(qū)被海水覆蓋，但對(duì)浮游生物群落呼吸（CR）的直接測(cè)量卻相對(duì)較少。由于用于測(cè)定O2濃度的應(yīng)用方法（例如Winkler滴定法或Clark型傳感器）的分辨率低且檢測(cè)限高（，1 mmol L-1），因此很難通過實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)海水來直接測(cè)量氧氣消耗率[1]。因此，直接呼吸測(cè)量在很大程度上被限制在最活躍的上層海洋200 m處，導(dǎo)致數(shù)據(jù)庫在季節(jié)、緯度和深度方面存在很大偏差[2,3]。在中層和深海海水、貧營養(yǎng)區(qū)和天然低氧水域（如氧氣最低區(qū)（OMZ））中發(fā)現(xiàn)的低速率的直接測(cè)量基本上是缺失的，我們通常依賴于估計(jì)值[4–6]。由于缺乏對(duì)海洋（150米以下）的微光區(qū)和暗區(qū)的測(cè)量，這兩個(gè)區(qū)域占海洋體積的98%，在光層多余有機(jī)物的礦化、儲(chǔ)存和埋藏中起著關(guān)鍵作用[7]，影響了我們獲得可靠的海洋浮游呼吸總體估計(jì)值的能力，以及由此得出的全球碳預(yù)算[8]。根據(jù)從占海洋表面80%的非生產(chǎn)性水生系統(tǒng)[9]獲得的有爭(zhēng)議的結(jié)果，尚未解決的討論仍在繼續(xù)。據(jù)估計(jì)，這些地區(qū)的呼吸速率大大超過初級(jí)生產(chǎn)力，表明當(dāng)?shù)貎舢愷B(yǎng)[10–12]。另一方面，通過不同類型的數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)公海的有機(jī)碳收支基本上與有機(jī)碳平衡[13]。

同樣，缺乏氧氣最低區(qū)水域有氧呼吸過程的詳細(xì)數(shù)據(jù)限制了我們對(duì)其建立和發(fā)展的理解和預(yù)測(cè)能力[14]。此外，為了通過直接測(cè)量耗氧量來評(píng)估CR率，通常采用較長的孵育時(shí)間（$24小時(shí)），因?yàn)檫@是不可避免的，因?yàn)楹粑实?，技術(shù)靈敏度低。然而，長時(shí)間的孵化可能會(huì)導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)的變化，導(dǎo)致對(duì)比率的不切實(shí)際的估計(jì)[15,16]。因此，需要更可靠、更準(zhǔn)確的測(cè)量方法，以及常規(guī)評(píng)估低放射性水域鉻含量的新方法。

最近，通過使用改進(jìn)版的電子傳輸系統(tǒng)（ETS）酶法測(cè)定微型浮游生物呼吸速率[17]，報(bào)告了呼吸速率的較低檢測(cè)限[18]。在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)（在寡養(yǎng)水體中為3至5.5小時(shí)），通過還原2-對(duì)（碘苯基）-3（硝基苯基）-5（苯基）氯化四氮唑（INT），在體內(nèi)估計(jì)ETS的活性。該方法的分析檢出限為64 nmol L-1不溶性福爾馬贊晶體（INT-F）。該值相當(dāng)于80 nmol L-1 O2，使用電子傳遞系統(tǒng)（R/ETS比率）測(cè)量的呼吸速率和酶活性之間的比率（12.8）將ETS活性轉(zhuǎn)化為碳呼吸。因此，通過測(cè)量真實(shí)的原位生理速率而不是體外潛在呼吸，該方法應(yīng)超越標(biāo)準(zhǔn)ETS測(cè)定的限制。盡管其檢測(cè)限有所提高，但這類酶法用于呼吸測(cè)量的有效性和準(zhǔn)確性受到了嚴(yán)重質(zhì)疑[6]。

近年來，開發(fā)了用于高精度測(cè)量氧濃度的新型傳感器。因此，高分辨率STOX傳感器和高靈敏度光學(xué)傳感器（optodes）是研究水生呼吸的合適且有希望的工具[19][20]。

為了克服與之前在低活性和低氧水域中的呼吸測(cè)量相關(guān)的技術(shù)和方法問題，我們開發(fā)并驗(yàn)證了一種以低速率直接定量CR的程序。這是使用高分辨率STOX傳感器[19]在人為降低的O2濃度下完成的，并假設(shè)在低和高O2濃度下的速率是可比較的。需要較低的O2濃度才能達(dá)到該方法的最高靈敏度。然而，上述比較無法在低活性海洋水域進(jìn)行測(cè)試，因?yàn)樵诟哐鯘舛认碌奈鮿?dòng)力學(xué)無法用任何標(biāo)準(zhǔn)方法可靠解析。因此，我們首先在高活性沿海水域進(jìn)行了一項(xiàng)比較研究，其中氧消耗率由STOX法和標(biāo)準(zhǔn)溫克勒滴定法測(cè)定。此后，我們使用STOX方法評(píng)估來自熱帶北太平洋東部（ETNP）OMZ的海水中的CR率。此外，我們還介紹了各種浮游生物群落從完全有氧條件到幾乎零氧條件下的耗氧動(dòng)力學(xué)；探索一個(gè)新的，描述不清的，有氧呼吸仍在發(fā)生的濃度范圍。

材料和方法

道德聲明

本研究中使用的三個(gè)丹麥地點(diǎn)的水的獲取和取樣無需特別許可。在“Thomas G.Thompson”號(hào)客輪的東熱帶北太平洋（ETNP）巡航（2012年3月至4月）期間，在墨西哥水域航行、取樣和工作，需獲得墨西哥政府的許可。對(duì)于所有站點(diǎn)和所有實(shí)驗(yàn)，均未涉及瀕?；蚴鼙Ｗo(hù)物種。

圖1。培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)用玻璃瓶，容積為1160 mL（注入紅色墨水以增加對(duì)比度）。A）用于插入STOX傳感器的開口（內(nèi)徑8.1 mm）；B）用于壓力補(bǔ)償?shù)拈L開口玻璃管（內(nèi)徑2.5 mm）（管內(nèi)注入藍(lán)色墨水以增加對(duì)比度）；C）玻璃涂層磁鐵（2.5厘米），用于持續(xù)攪拌。內(nèi)政部：10.1371/期刊。波內(nèi)。0105399.g001

研究地點(diǎn)和抽樣

從丹麥的三個(gè)不同地點(diǎn)采集海水和微咸水樣本（圖S1）。在三個(gè)季節(jié)（2011年6月至7月、2011年9月和2013年1月至2月）對(duì)兩個(gè)主要地點(diǎn)（圣城1號(hào)和圣城2號(hào)）進(jìn)行了采樣，額外的圣城3號(hào)僅在2013年2月進(jìn)行采樣，如下所述。1號(hào)站位于Randers峽灣（56u31912.2299N；10u13948.5999E），受其內(nèi)部?jī)蓷l河流的淡水排放和高有機(jī)負(fù)荷的影響[21]。采樣期間（2011年6月、9月和2013年1月），采樣點(diǎn)的鹽度范圍為7%至9%。2號(hào)站位于奧胡斯Marselisborg Marina附近的卡特加特（56u08914.3299N；10u12955.1999E）。采樣點(diǎn)非常靠近海岸線，采樣期間（2011年7月、9月和2013年1月）鹽度在16%到26%之間。2013年2月取樣的3號(hào)站位于丹麥北海海岸（57u0791299N；08u3791299E）漢斯霍姆港，鹽度為35%。收集表層海水，通過250mm篩網(wǎng)過濾以去除較大的動(dòng)物群，并在采樣后3小時(shí)內(nèi)將其裝在干凈的聚乙烯容器中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

在R/V Thompson（2012年3月和4月）上的ENTP春季巡航期間，該方法也被用作在東熱帶北太平洋（ETNP）氧氣最低區(qū)（4號(hào)站，16u29993.2599N，109u59900.5999W）的船上試驗(yàn)。4號(hào)站距離墨西哥海岸約700公里（圖S1）。海水樣品用10 L Niskin瓶花環(huán)采集于110 m處，剛好低于氧氣層。在該深度，通過使用STOX傳感器的高分辨率原位氧氣分析，發(fā)現(xiàn)無法檢測(cè)到溶解氧[22]。取樣后不久進(jìn)行瓶培養(yǎng)，如下所示。

設(shè)置和實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在1160 mL的定制改良Schott Duran玻璃瓶中進(jìn)行（圖1）。一根25厘米長的玻璃管（內(nèi)徑0.25厘米）穿過瓶子一側(cè)的玻璃壁。它用于壓力補(bǔ)償，以便溫度-體積變化不會(huì)導(dǎo)致氣泡形成和其他不良影響。一根更寬的玻璃管（內(nèi)徑0.8厘米）取代了原來的瓶頸，用于插入STOX氧傳感器。瓶子內(nèi)容物僅在毛細(xì)管頂部的水-空氣界面處與空氣接觸（圖1b），但由于該毛細(xì)管的內(nèi)徑較小，氧氣進(jìn)入瓶子的傳輸可忽略不計(jì)（見結(jié)果部分）。STOX傳感器的直徑在8 mm瓶頸的0.1 mm范圍內(nèi)，因此與空氣的接觸僅限于0.3 cm距離內(nèi)的超薄水層（圖1 a）。由于STOX傳感器和8毫米頸部之間的強(qiáng)毛細(xì)管作用，任何體積變化將僅在壓力補(bǔ)償管中可見。

圖2。對(duì)照實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（實(shí)驗(yàn)1）。顯示了具有不同氧濃度的四個(gè)不同重復(fù)。添加64 h 1 mL空氣，飽和0.05 M HCl，在毫質(zhì)量水中，對(duì)應(yīng)于244 nmol L-1 O2，用于傳感器校準(zhǔn)。內(nèi)政部：10.1371/期刊。波內(nèi)。0105399.g002

在實(shí)驗(yàn)過程中，瓶子被置于黑暗中，浸泡在恒溫（15uC和21uC）的水浴中。使用2.5 cm長的玻璃涂層磁鐵（Fisher Scientific）（圖1 C）進(jìn)行連續(xù)攪拌，同時(shí)將裝有瓶子的容器置于磁攪拌器（IKA）頂部。

為了在測(cè)量氧氣濃度時(shí)獲得最高的相對(duì)分辨率，使用STOX傳感器時(shí)，必須在低氧氣濃度下工作。因此，通過使用混合有0.05%CO2的N2鼓泡來降低待研究水的O2濃度。

由于灌裝過程中的空氣污染，很難在瓶中獲得非常低的O2濃度，但以下程序可使初始濃度降至約100 nmol-1。將待調(diào)查的水與N2混合0.05%CO2鼓泡約15分鐘，同時(shí)將其封閉在一個(gè)10或20升的玻璃瓶中，該玻璃瓶只有一個(gè)小開口，以允許氣體逸出。然后，使用帶有泰貢管接頭的玻璃管虹吸管從儲(chǔ)液罐中注滿瓶子，同時(shí)仍在冒泡。泰貢是首選，因?yàn)樗鄬?duì)不透氧且透明，因此可以觀察到不需要的氣泡的存在。通過壓力補(bǔ)償管進(jìn)行填充，同時(shí)通過插入8mm頸部的5mm泰貢管將惰性氣體流保持在瓶子內(nèi)。在保持氣流和水流入的同時(shí)，將瓶子倒置，丟棄流入瓶子的前50-100毫升水；之后，瓶子被完全填滿。然后立即插入STOX傳感器，同時(shí)中斷通過虹吸管的水流。

所有試驗(yàn)均在取樣后30小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，培養(yǎng)最長持續(xù)時(shí)間為20小時(shí)。所有玻璃器皿先在0.1 M NaOH中清洗，然后在0.1 M HCl中清洗，以避免有機(jī)污染。

對(duì)STOX方法進(jìn)行了測(cè)試（實(shí)驗(yàn)1），并與丹麥沿海和峽灣水域的標(biāo)準(zhǔn)Winkler技術(shù)進(jìn)行了比較（實(shí)驗(yàn)2）；隨后，將STOX方法應(yīng)用于海洋水域，以評(píng)估ETNP OMZ中間深度的CR率（見表3）。

實(shí)驗(yàn)1-測(cè)試方法。氧內(nèi)流和傳感器穩(wěn)定性的控制實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)1中，上述設(shè)置用于評(píng)估方法的準(zhǔn)確性和分辨率，以及檢查外部和內(nèi)部O2污染的可能來源。因此，用生物非活性水建立了一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其中在4個(gè)重復(fù)瓶中監(jiān)測(cè)O2濃度，該瓶中裝有0.05 M HCl和軟化水，軟化水經(jīng)過煮沸、冷卻，然后用N2氣體脫氣至低O2水平（圖2）。

實(shí)驗(yàn)2-方法在沿海水域的應(yīng)用和比較。在實(shí)驗(yàn)2中，使用相同的設(shè)置和程序，在三個(gè)不同季節(jié)用STOX法測(cè)量了St.1、2和3的浮游生物群落呼吸率。為St.1、2和3設(shè)置一組平行培養(yǎng)瓶（n=3），以比較用STOX法（在低氧濃度下）獲得的CR率與用Winkler滴定法在空氣飽和時(shí)測(cè)得的呼吸率。此外，浮游生物群落的動(dòng)力學(xué)參數(shù)由STOX方法獲得的數(shù)據(jù)建模。對(duì)于空氣飽和條件下的培養(yǎng)，重復(fù)上述相同的程序，但在這種情況下，用水輕輕地鼓入空氣，并用實(shí)心玻璃棒更換STOX傳感器以關(guān)閉瓶子。在孵育24小時(shí)之前和之后，通過Winkler滴定法在12 mL Exetainers（n=6）中采集氧氣測(cè)定樣品。按照Labasque等人[23]描述的程序，通過分光光度法測(cè)定O2濃度。

實(shí)驗(yàn)3-海洋水域中的方法應(yīng)用。在實(shí)驗(yàn)3中，用STOX方法測(cè)量了太平洋St.4海洋樣本的浮游生物群落呼吸速率（圖S1）。

葉綠素a提取

對(duì)于每個(gè)站點(diǎn)，在開始瓶培養(yǎng)之前，通過Advantec GF-75玻璃纖維過濾器過濾1L海水，然后用96%乙醇提取色素，從取樣水中提取葉綠素a[24]。測(cè)量分四次進(jìn)行，葉綠素a濃度根據(jù)Lorenzen方法計(jì)算[25]。

傳感器：原理、校準(zhǔn)和電子學(xué)

STOX傳感器是一種安培式氧傳感器，具有就地零點(diǎn)校準(zhǔn)的內(nèi)置功能。該傳感器由內(nèi)部氧微傳感器[26]組成，內(nèi)部氧微傳感器位于外部微傳感器外殼內(nèi)，外部微傳感器外殼配有額外的硅膜。在兩個(gè)膜之間，放置一個(gè)由多孔金制成的外陰極（前防護(hù)罩）。該前防護(hù)罩在20.8 V電壓下的極化消耗了從外部介質(zhì)擴(kuò)散到測(cè)量傳感器的所有氧氣，導(dǎo)致現(xiàn)場(chǎng)零電流測(cè)定。隨后前防護(hù)罩的去極化允許氧氣通過并到達(dá)測(cè)量陰極。測(cè)得的電流差與氧濃度成正比。由于每個(gè)測(cè)量循環(huán)都記錄了新的零點(diǎn)讀數(shù)，因此該信號(hào)與零點(diǎn)漂移無關(guān)，并允許定義零O2濃度。零點(diǎn)測(cè)定的高精度允許非常高的低O2濃度分辨率，而在接近空氣飽和的濃度下首選其他方法。與標(biāo)準(zhǔn)氧氣微傳感器相比，STOX傳感器具有較高的攪拌靈敏度，且整個(gè)循環(huán)的響應(yīng)時(shí)間相對(duì)較長（20秒至幾分鐘），因此，它們最適合在氧氣濃度變化相對(duì)緩慢的攪拌介質(zhì)中進(jìn)行分析，如本文所述的瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。微傳感器是按照前面的描述制造的[19,27]。在每次實(shí)驗(yàn)期間，通過向瓶子中注入已知體積的空氣飽和水，對(duì)每個(gè)傳感器進(jìn)行校準(zhǔn)。傳感器連接到PA8000八通道皮安計(jì)（Unisense a/S，丹麥），而前防護(hù)的極化和去極化由定制的定時(shí)器控制開關(guān)箱調(diào)節(jié)，前防護(hù)的開啟和關(guān)閉周期定時(shí)器設(shè)置為250秒。信號(hào)由Unisense ADC816 16位a/D轉(zhuǎn)換器采集，該轉(zhuǎn)換器使用Sensortrace Basic程序連接至便攜式PC（Unisense a/S，丹麥）（圖S2）。

圖3。與沿海海水孵育的STOX傳感器中氧氣消耗的時(shí)間過程。來自站點(diǎn)2水孵化的STOX傳感器數(shù)據(jù)示例（Marselisborg Marina，2011年9月）。僅繪制每個(gè)循環(huán)期間的最小和最大讀數(shù)，并用線連接。最大和最小讀數(shù)之間的差值用作O2濃度的測(cè)量值。信號(hào)的初始振幅（11 pA）對(duì)應(yīng)于200 nmol-1瓶中的O2濃度。如紅線所示，在1h（2ml，600nmol-1）和6.7h（4ml，1200nmol-1）注射空氣飽和水。內(nèi)政部：10.1371/期刊。波內(nèi)。0105399.g003

動(dòng)力學(xué)參數(shù)的數(shù)據(jù)分析與建模

在每組培養(yǎng)中連續(xù)記錄氧氣濃度，最長持續(xù)20小時(shí)。氧氣消耗率通過氧氣濃度隨時(shí)間的線性回歸計(jì)算得出。利用STOX方法獲得的數(shù)據(jù)，通過離散O2間隔上的運(yùn)行斜率計(jì)算斜率。對(duì)于高于6 mmol L-1的O2濃度，使用2 mmol L-1間隔，并且隨著O2的減少，逐漸降低濃度范圍。線性模型的擬合通過確定系數(shù)r2進(jìn)行評(píng)估。

Michaelis-Menten方程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax（最大呼吸速率）和Km（表觀半飽和常數(shù)）：

通過直接對(duì)每個(gè)復(fù)制的進(jìn)度曲線（濃度與時(shí)間）進(jìn)行非線性參數(shù)擬合來估計(jì)。數(shù)據(jù)符合方程（2），該方程描述了氧隨時(shí)間的逐漸吸收[28]：

式中，C（t）是氧濃度隨時(shí)間的函數(shù)，Co是所考慮間隔的初始濃度。Vmax和Km迭代變化，直到使用Excel中的解算器命令實(shí)現(xiàn)通過最小二乘法調(diào)整獲得的最佳擬合[29]。

為了測(cè)試動(dòng)力學(xué)參數(shù)是否隨時(shí)間變化，在同一個(gè)瓶子中和幾個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過在氧氣濃度接近零時(shí)注入空氣飽和水，測(cè)定了兩次Km和Vmax值。

為了在模型和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間獲得更好的擬合，我們還測(cè)試了一個(gè)經(jīng)驗(yàn)關(guān)系，該關(guān)系最初是為光合作用的光飽和曲線而建立的[30]。Jassby和Platt方法表示呼吸速率與氧濃度的關(guān)系如下：

其中a是低氧水平下曲線的初始斜率。為了使用半飽和常數(shù)（Km），對(duì)方程進(jìn)行了修改，采用以下關(guān)系式，表示符合Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)的速率-濃度曲線的初始斜率：

結(jié)合方程式3和4：

與使用Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)類似，培養(yǎng)過程中氧濃度的時(shí)間演變符合以下方程式：

遵循與上述相同的迭代過程。