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討論
如引言中所述，兩種主要的水文地球化學類型的地下水在O ki u t深度分層，被深度介于250和350 m之間的混合層隔開。因此，這種隨深度的變化為微生物多樣性和活動提供了截然不同的地球化學環(huán)境。這些層的454個序列多樣性差異很大，ONK-PVA6地下水庫中大多數(shù)與RB相關的序列代表混合層（表6）。這與可培養(yǎng)微生物的結果（表3）以及之前關于混合層中硫酸鹽顯著還原為硫化物的觀察結果一致（P d s n等，2008）。相比之下，注入ONK-KR15的深層地下水系統(tǒng)呈現(xiàn)“沙漠狀”，可培養(yǎng)細胞的多樣性非常低，即只有兼性厭氧菌具有硝酸鹽還原能力（表3）。
值得注意的是，沒有硫酸鹽似乎從ONK-KR15地下水和生物膜序列庫中排除了RB相關序列。然而，的物種豐富度（即分類單元數(shù)&t;0%）和計算的序列多樣性指數(shù)（表6 ONK-KR15）略高于ONK-PVA6地下水。ONK-KR15序列庫中最豐富的序列與潛在的自養(yǎng)、利用屬有關氫的Hyd n p（Wi ms等人，1989）和假單胞菌屬，硫桿菌屬，和Fusib t（R v t等人，1999年）。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基沒有補充這些屬所使用的電子供體和受體，如氫和硫代硫酸鹽，這可能有利于它們的生長。鑒于這些新結果，現(xiàn)在可以重新設計培養(yǎng)基以增加可培養(yǎng)微生物的種類。由于針對PCR引物古細菌的在該分析中未使用，因此分析ONKALO地下水中古細菌的完整多樣性的任務仍然存在。
觀察到的序列多樣性
在103天的實驗時間和兩次處理中，生物膜的多樣性變化很?。▓D4）。OTU序列的比對分析以&t;3%的豐度出現(xiàn)，表明它們在地下水和所有四種生物膜樣品之間是相同的，除了Hyd n p序列，樣品之間的OTU組成有所不同。類似地，作為ATP分析的生物量（表4）和生物膜多樣性在103天后幾乎沒有變化，這意味著ONK-KR15生物膜的多樣性水平恒定。生物膜經(jīng)過處理和時間的可重復454熱標簽測序結果清楚地證明了DNA提取和454熱標簽測序方法的可重復性和穩(wěn)健性，其中每個生物膜都可以被視為獨立的測序樣本。
觀察到的獨特OTU的數(shù)量在108-135個范圍內(nèi)（表6），比以前在K i發(fā)現(xiàn)的更多（i in t.2006）和芬諾斯堪底亞盾（P d s n等人。1996年,1997)使用克隆和測序的地下水，但比使用454熱標簽測序在冰下水（即208-410個OTU；M t inss n等人2013），比深的海水中發(fā)現(xiàn)的（少了10次in等人。2006）。觀察到的454個序列與報告給nB nk的沉積物、鹽沼、地下水、污泥和湖水的序列大致相當（表7）。然而，盡管相似性接近100%，但B st結果過于多樣化，無法得出關于從ONKALO觀察到的OTU的全球站點特異性的結論。
O ki u t的深層鹽水和微堿性地下水可能受到更深的超鎂鐵質(zhì)環(huán)境的影響，并持續(xù)蛇紋石化，這可以解釋觀察到的非常高濃度的甲烷和氫氣（w d L等人，1993).這樣地下環(huán)境似乎豐富Hyd n p別處（·布拉澤爾頓博士等人的2013）。在ONK-KR15的情況下提出了類似的富集，因為該屬在454序列庫中占主導地位。少數(shù)百分比的古細菌數(shù)據(jù)集中序列與來自南非金礦深部含鹽地下水的T m p sm t序列有關（i in等人，2007年）。2006；高井等人。2001）。的主導地位Hyd n p OTU表明，深部地下生命的多樣性受環(huán)境參數(shù)控制，這些環(huán)境參數(shù)調(diào)節(jié)具有相關生理和代謝能力的各種屬的生長和活動。主要的相關參數(shù)是各種碳和電子供體和電子受體的存在與否。
硫酸鹽對RB多樣性和活性的影響
ONK-KR15和ONK-PVA6地下水在地球化學上的唯一主要區(qū)別是ONK-KR15地下水中不含硫酸鹽和硫化物（表1）。這種差異極大地影響了觀察到的可培養(yǎng)RB數(shù)量和RB的16 DNA多樣性，這在ONK-PVA6地下水中很大，而在ONK-KR15中幾乎不存在（圖4、表3和7）。由于硫酸鹽是混合層中主要的可用電子受體，甲烷可能是硫酸鹽還原的最大電子供體，其濃度是第二大潛在電子供體DOC的10倍（表1表和2）。然而，與甲烷不同，如果被微生物氧化，可以通過擴散和地下水運動從富含甲烷的深層層不斷補充，DOC必須通過化學或光自養(yǎng)代謝過程合成。
在之前的一項研究中，在裝有ONK-PVA6地下水的FCC中觀察到最多產(chǎn)生320μM的醋酸鹽，推測醋酸鹽是由使用甲烷作為碳源的微生物產(chǎn)生的（P d s n 2013）。幾個在ONK-PVA6（所述RB的表7）被稱為完整乙氧化屬，即，D su f b t ium（B ys等人1987），D su f b u，和D su f ti num（Ku v等。2001）。因此，與乙酸鹽的存在及其可能從甲烷中產(chǎn)生的結果一致，目前和以前的結果表明，中深層富含硫酸鹽和深層富含甲烷的地下水的混合誘導了使用甲烷和乙酸鹽作為硫酸鹽還原微生物群落ONK-PVA6含水層中的關鍵電子和碳供體。
ONKALO隧道的建設導致富含硫酸鹽的地下水與深層富含甲烷的地下水混合。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，混合層在與ONKALO隧道相交的裂縫中緩慢移動到更深處。ONK-PVA6鉆孔于2009年11月3日至4日鉆孔，當時地下水缺乏硫酸鹽。截至2012年4月12日，由于水位下降，硫酸鹽濃度自那時起緩慢上升至1.9 mM。此處報告的FCC實驗旨在模擬這種人類引起的地下水地球化學轉變，該轉變正在緩慢深入在ONKALO中，觸發(fā)混合層中的RB生長。具有硫酸鹽還原能力的序列和培養(yǎng)物以相似的比例出現(xiàn)在富含硫酸鹽的FCC的地下水和生物膜中，即大約占細胞和序列總數(shù)的1%（表1和7）。因此，硫酸鹽是導致ONK-KR15地下水中RB生長所需的唯一化合物。添加ONK-PVA6地下水對序列多樣性和可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響很小。
ONK-PVA6地下水具有代表序列D su f bu的，這是一種在硫酸鹽+ONK-PVA6生物膜中發(fā)現(xiàn)的OTU，但在硫酸鹽生物膜中沒有。否則，兩種處理沒有顯著差異。硫酸鹽作用緩慢，可培養(yǎng)RB的MPN增加需要60 d以上（圖3）。這與E的時間一致硫酸鹽FCC中接近–250 mV，這是一個典型的E，之前在FCC中觀察到RB活動（P d s n 2012b）。雖然在對照生物膜454序列庫中沒有檢測到RB相關序列，但在稀有生物圈中可能仍然存在一些RB屬的細胞（in等人2006)硫酸鹽處理后可以生長的FCC。因此，F(xiàn)CC實驗證實了以下假設：硫酸鹽是在O ki u t缺乏硫酸鹽的深層地下水中引起RB生長所需的唯一化合物。
高k米為37毫米的甲烷已被報道用于甲烷（AOM）處理的沉積物中的厭氧氧化（Z n等人2010）。如果甲烷是RB群落的主要電子供體，觀察到的細胞數(shù)量緩慢增加和硫酸鹽修正FCC序列庫中RB相關OTU的有限代表可能如此高K m與硫酸鹽AOM的有關.因此，盡管硫酸鹽修正的FCC中可能一直在使用硫酸鹽AOM，但該過程可能太慢，無法在大約4.5 mM的表觀甲烷濃度下進行檢測。
病毒（即攻擊地下水中微生物的噬菌體）的存在必須源自宿主微生物的裂解感染。A PO硬巖實驗室地下水噬菌體豐富的調(diào)查返回大量多樣化的噬菌體人口（凱爾等人。2008年）。VLP與TNC的平均比率為12，表明微生物種群活躍。如果深層地下水中的噬菌體具有活性和裂解性，它們將構成可能控制微生物數(shù)量和活動的重要捕食者群體。此外，它們的存在表明它們的獵物——微生物——是活躍的并且正在生長。VLP與TNC的比例在實驗的前半部分很高，之后下降到2-4（圖1）。這種減少與硫酸鹽修正的FCC中NRB和RB的增加相吻合（圖2和b)。似乎噬菌體最初對FCC中的微生物細胞（尤其是RB）的數(shù)量產(chǎn)生了顯著的控制作用。
總之，這項工作證明了深層地下水組成與微生物多樣性之間存在明顯的關系。地下水中僅存在/不存在一種地球化學參數(shù)，即硫酸鹽，導致了非常大的群落轉變。因此，研究的地下微生物群落有能力通過表現(xiàn)群落轉變來響應地球化學環(huán)境的變化。培養(yǎng)和454熱標簽測序均表明RB群落在存在硫酸鹽的深層生物圈中非常具有競爭力。由于RB活動會產(chǎn)生對金屬具有腐蝕性的硫化物，因此在評估微生物過程對未來金屬罐中放射性廢物地質(zhì)處置的影響時，應考慮這些結論。
致謝
由阿爾弗雷德P.斯隆基金會支持的深碳天文臺深生命普查計劃使熱標簽測序數(shù)據(jù)成為可能。Py t測序是在海洋生物實驗室（美國馬薩諸塞州伍茲霍爾）進行的，我們在那里得到了n im、Hi y M is n、us n Hus、Mit in、J s p Vin is和And w V is的大力幫助。M it Y i-K i在ONKALO站點的協(xié)助是一流的，不可或缺的。作者感謝瑞典微生物分析的Bj?n H b k、J ssi J nss n和Lind J nss n，感謝他們出色的實驗室工作。
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