結(jié)果

地下水表征

2012年4月12日對(duì)ONK-PVA6和ONK-KR15地下水的地球化學(xué)進(jìn)行了分析（表1）。所示的地下水參數(shù)比值表1表明，兩種試驗(yàn)地下水類(lèi)型僅在硫化合物含量上存在顯著差異；否則，大多數(shù)其他參數(shù)最多相差2倍，這主要?dú)w因于ONK-KR15地下水的鹽度高于ONK-PVA6地下水。2012年1月11日和4月17日對(duì)ONK-KR15地下水中的溶解氣體成分進(jìn)行了兩次分析，2012年9月18日對(duì)ONK-PVA6地下水進(jìn)行了一次分析（表2）。與ONK-PVA6地下水相比，ONK-KR15中含有更多的溶解氣體，尤其是甲烷和氫氣。

有1.8×10 4個(gè)細(xì)胞mL-1和4.5×10 3 amol ATP mL-1 2012年1月11日采樣的OL-KR15的地下水中（表3）。NRB在MPN測(cè)定中占主導(dǎo)地位，只有NRB和MRB的MPN高于檢測(cè)限。有4.9×10 4個(gè)細(xì)胞mL-1和1.06×10 4 amol ATP mL-1 2012年4月17日采樣的OL-PVA6的地下水中（表3）。IRB和MRB主導(dǎo)MPN測(cè)定，NRB和SRB的MPN也高于檢測(cè)限。

FCCS中的TNC、VLP和ATP

在細(xì)胞總數(shù)mL-1和ATP mL的量-1大部分實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，F(xiàn)CCS之間的沒(méi)有顯著差異，但在所有三個(gè)系統(tǒng)中都有增加的趨勢(shì)（圖2a和b）。類(lèi)似地，的ATP g量-1僅在硫酸鹽+ONK-PVA6 FCCS中，巖石顆粒隨時(shí)間顯著不同（表4）。VLPs的數(shù)量在所有FCCS中大致恒定，每個(gè)細(xì)胞的VLPs數(shù)量在對(duì)照和硫酸鹽FCCS中最高，而這個(gè)數(shù)量在硫酸鹽+ONK-PVA6 FCCS中較低（圖2c）。在剩余的實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，每個(gè)細(xì)胞的VLP數(shù)量在大約40天后從平均20個(gè)顯著減少到平均2-3個(gè)。每個(gè)細(xì)胞VLP的這種減少與TNC和ATP濃度的增加有關(guān)。噬菌體的裂解活性似乎隨著時(shí)間的推移而降低，為增加未附著的生物量留出了空間。

表4.來(lái)自FC 2(巖石顆粒上的ATP n=3)和FC 4(n每個(gè)流動(dòng)池循環(huán)系統(tǒng)中=3)的量

圖2.(a)細(xì)胞總數(shù)(TNC)，(b)ATP濃度，(c)每細(xì)胞總數(shù)(TNC)中病毒樣顆粒(VLP)的數(shù)量，以及(d)溶解甲烷的濃度在通過(guò)三個(gè)流通池柜循環(huán)的地下水中，補(bǔ)充有500 mL ONK-KR15地下水(?)、500 mL ONK-KR15地下水和1 mM NaSO 4(?)，以及500 mL ONK-PVA6地下水和1 mM NaSO 4（?）。條形表示±1標(biāo)準(zhǔn)偏差；n=3 in(a)–(b)。

FCCS中培養(yǎng)的微生物和有機(jī)酸

SRB的MPN增加到大約10 4個(gè)細(xì)胞mL-1在兩種硫酸鹽修正的FCCS中都并且中接近檢測(cè)極限（即，0.2個(gè)細(xì)胞mL-1在缺乏硫酸鹽的對(duì)照FCCS）（圖3a）。NRB的MPN在硫酸鹽+ONK-PVA6 FCCS中40天后最高（圖3b）。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)，所有三個(gè)FCCS都具有相似的NRB MPN。IRB的MPN隨時(shí)間變化，在硫酸鹽+ONK-PVA6 FCCS中最高（圖3c）。同樣，在所有FCCS的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，CHAB的數(shù)量大致相似，平均約為5×10 4細(xì)胞mL-1（圖3d）。AA的MPN在對(duì)照系統(tǒng)中處于檢測(cè)極限，增加至最多1-10 AA mL-1在硫酸鹽修正系統(tǒng)中，并且在任何FCCS中均未產(chǎn)生乙酸鹽。在所有FCCS的所有采樣場(chǎng)合，HM的MPN均低于檢測(cè)限。乙酸鹽和DOC的濃度相對(duì)于采樣時(shí)間0的起始值沒(méi)有變化，分別為18μM乙酸鹽和0.25μM DOC。

圖3.(a)硫酸鹽還原菌(SRB)的最可能數(shù)(MPN)，(b)硝酸鹽還原菌(NRB)的MPN，(c)鐵還原菌(IRB)的MPN，(d))可培養(yǎng)的異養(yǎng)需氧菌(CHAB)，(e)E h使用內(nèi)部電極對(duì)測(cè)量的：四個(gè)電極信號(hào)的平均值（e中的藍(lán)線），在硫酸鹽流通池循環(huán)系統(tǒng)(FCCS)中（e中的紅線），和在硫酸鹽+ONK-PVA6 FCCS中（e中的綠線），以及(f)通過(guò)三個(gè)FCCS循環(huán)的地下水中的硫酸鹽濃度，并輔以500 mL ONK-KR15地下水(?)、500 mL ONK-KR15地下水和1 mM NaSO 4(?)，以及500 mL ONK-PVA6地下水和1 mM NaSO 4(?)。

FCCS中的化學(xué)

甲烷濃度相對(duì)于起始值降低了大約15%（圖2d）。硫酸鹽+ONK-PVA6 FCCS中的甲烷較少，因?yàn)樘砑拥腛NK-PVA6地下水比ONK-KR15地下水含有更少的甲烷（表2）。pH在所有FCCS中以大致相同的速度下降，在103天后從大約8.2的起始值下降到大約7.5。的E h正如內(nèi)部微電極所記錄的那樣，對(duì)照和硫酸鹽FCCS在70天后下降到大約-250 mV的穩(wěn)定水平（圖3e）。的E h到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，硫酸鹽+ONK-PVA6 FCCS緩慢下降至大約-100 mV。添加硫酸鹽導(dǎo)致硫酸鹽FCCS中的硫酸鹽為1 mM，而硫酸鹽+ONK-PVA6 FCCS中的濃度略高；這種差異是由于添加的ONK-PVA6地下水中的高硫酸鹽濃度(1.9 mM)（圖3f）。硫酸鹽濃度在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)沒(méi)有變化，并且低于對(duì)照FCCS中的檢測(cè)值。在所有采樣情況下，所有FCCS中的硫化物濃度均低于檢測(cè)值。在所有FCCS中，亞鐵濃度增加到大約20μM。

MPN培養(yǎng)物的克隆和16S rDNA測(cè)序

從第82天和第103天接種的陽(yáng)性NRB和SRB培養(yǎng)物的最高稀釋液中提取的DNA被克隆和測(cè)序（表5）。序列數(shù)據(jù)揭示了來(lái)自研究的MPN培養(yǎng)物的總共八個(gè)克隆分類(lèi)群。發(fā)現(xiàn)的序列代表了Deltaproteobacteria、Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria phyla。優(yōu)勢(shì)種屬是Desulfovibrio aespoeensis和Pseudomonas stutzeri，分別有41和14個(gè)克隆觀察結(jié)果；這些克隆與NCBI GenBank中的數(shù)據(jù)庫(kù)記錄有99.9-100%的相似性。

表5.在第82天和第103天從硫酸鹽和硫酸鹽+ONK-PVA6流通池循環(huán)系統(tǒng)采樣的SRB和NRB MPN培養(yǎng)物克隆中檢測(cè)到的分類(lèi)群

地下水和生物膜提取中的DNA回收

提取的DNA總量為26至243×10-9 g（表6）。平均量的DNA的在一個(gè)典型的地下水細(xì)菌，例如，D.aespoeensis（Motamedi和Pedersen 1998），是649個(gè)道爾頓/堿基對(duì)×3629109個(gè)堿基（軌跡CP002431）=2.36×10 9道爾頓細(xì)胞-1=2.36×10 9道爾頓細(xì)胞-1×1.6605402×10-24 g道爾頓-1=3.9×10-15 g DNA細(xì)胞-1。從ONK-KR15中過(guò)濾了大約57 L的地下水，DNA回收率為63×10-9 g DNA（表6），這對(duì)應(yīng)于1.62×10 7基于的DNA估計(jì)的平均大小的細(xì)胞D.aespoeensis。在有1.8×10 4個(gè)細(xì)胞mL-1過(guò)濾開(kāi)始時(shí)，ONK-KR15地下水中（表3）。

表6.使用帶有MXPro軟件的Stratagene MX3005p熒光計(jì)和Molecular Probes的Quant-it Picogreen試劑盒進(jìn)行熒光分析的提取雙鏈DNA的量；在地下水和生物膜序列庫(kù)中觀察和估計(jì)的總OTU水平（>0%序列豐度）的多樣性

計(jì)算出的平均DNA回收率變?yōu)?.6%。以同樣的方式計(jì)算，ONK-PVA6地下水的DNA回收率為9.2%。在含水層排水過(guò)程中，深層地下水中的細(xì)胞數(shù)量趨于減少；如果發(fā)生這種情況，DNA回收率會(huì)更高，因?yàn)檫^(guò)濾過(guò)程中TNC的減少會(huì)增加觀察到的DNA量，超過(guò)過(guò)濾器上捕獲的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)生物膜使用相同的公式表明大約有2×10 6個(gè)細(xì)胞（g巖石顆粒）-1，這比ATP分析表明的多，即大約5×10 5個(gè)細(xì)胞（g巖石顆粒）-1，假設(shè)平均0.4 AMOL每個(gè)細(xì)胞ATP（Eydal和Pedersen 2007）。無(wú)法確定ATP是否低估了生物量，或者游離dsDNA是否被噬菌體裂解的細(xì)胞或死吸附細(xì)胞吸附在巖石上?？紤]到這些計(jì)算的輸入數(shù)據(jù)具有相對(duì)較大的不確定性，三種不同的測(cè)定，即DNA、TNC和ATP，相當(dāng)一致。

地下水16S rDNA v6v4序列多樣性

除了11個(gè)Desulfosporosinus讀數(shù)（=0.06%）外，ONK-KR15地下水的序列庫(kù)中不存在與SRB相關(guān)的序列（表7）。在18134個(gè)讀數(shù)中甚至沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他SRB OTU的單例。稀少曲線表明每個(gè)樣品捕獲了90-95%的16S rDNA多樣性。這一觀察結(jié)果與可培養(yǎng)SRB的缺乏非常吻合（表3）。顯性序列與氧化屬密切相關(guān)氫Hydrogenophaga(30.3%)(Willems et al.1989)其次是假單胞菌-(8.8%)和硫桿菌-(8.6%)相關(guān)序列（圖4）。

表7.來(lái)自生物膜和地下水的序列庫(kù)中硫酸鹽還原類(lèi)群（Deltaproteobacteria和Firmicutes）的出現(xiàn)率≥0.1%，并觀察到庫(kù)中的主要OTU及其在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)告的樣本位點(diǎn)

圖4.ONKALO地下水和FCCS生物膜樣品的v4v6熱標(biāo)簽測(cè)序文庫(kù)的組成。顯示了頻率豐度≥1%的序列。酒吧名稱：KR15=ONK-KR15地下水采樣于2012年4月17日；bf 0=第0天的生物膜；bf C=第103天的對(duì)照生物膜；bf S=第103天的硫酸鹽生物膜；bf S 6=第103天的硫酸鹽+ONK-PVA6生物膜；PVA6=2012年4月17日采樣的ONK-PVA6地下水。不適用：未注釋。條形圖上方的樹(shù)描繪了Morisita-Horn距離度量，該度量使用具有算術(shù)平均值(UPGMA)的未加權(quán)對(duì)組方法構(gòu)建，并具有物種級(jí)別的分類(lèi)深度。比例尺代表5%的核苷酸取代。

古細(xì)菌由與Euryarchaeota和Thermoplasmata(3.5%)相關(guān)的序列代表，后者序列先前已在南非深部金礦的樣本中描述過(guò)(Gihring等人2006）。與來(lái)自O(shè)NK-KR15地下水的序列庫(kù)不同，來(lái)自O(shè)NK-PVA6地下水的序列庫(kù)以454個(gè)與SRB屬或科相關(guān)的序列為主以Desulfobacula（33.3%）和Desulfobulbaceae，分別（23.2%）為代表（圖4）。ONK-KR15的三個(gè)最豐富的序列也在一定程度上在ONK-PVA6序列庫(kù)中被發(fā)現(xiàn)。ONK-PVA6和ONK-KR15序列庫(kù)中相似序列的發(fā)生率是合理的，因?yàn)樗哪Ｐ捅砻骱蠸RB的中等深度、富含硫酸鹽的地下水向下滲透并與含水層區(qū)域的深層、貧硫酸鹽地下水混合ONK-PVA6所連接的(Aalto et al.2011）。

生物膜16S rDNA v6v4序列多樣性

在生物膜樣品中觀察到明顯的系統(tǒng)發(fā)育相似性，并且每個(gè)FCCS處理的多樣性特征表明相對(duì)于第0天的生物膜多樣性在103 d內(nèi)幾乎沒(méi)有變化（圖4）。在ONK-KR15地下水中發(fā)現(xiàn)的許多OTU也在FC生物膜中發(fā)現(xiàn)。然而，一些屬似乎更喜歡浮游狀態(tài)，因?yàn)樗鼈冊(cè)谏锬ぶ袥](méi)有被發(fā)現(xiàn)或以非常低的頻率被發(fā)現(xiàn)。與Fusibacter、Thermoplasmata和Nitrospira在生物膜序列庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)OTU相關(guān)的序列。其他的，如Brevundimonas水庫(kù)OTU，在生物膜中的含量是地下中的10倍。

否則，在地下水中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)OTU在所有生物膜樣本中也以通?？杀容^的頻率豐度順序表示。的Hydrogenophaga，Lutibacter，和假單胞菌屬的OTU一起構(gòu)成大部分的序列讀數(shù)在>50％的序列豐度所有生物膜樣品中和構(gòu)成的序列的45％ONK-KR15地下水讀取。生物膜多樣性似乎構(gòu)成了地下水多樣性的良好預(yù)測(cè)指標(biāo)，反之亦然。

SRB在硫酸鹽修正的FCCS中的MPN為5000個(gè)細(xì)胞mL-1在第103天（圖3a），通過(guò)克隆表明為D.aespoeensis（表5），而對(duì)照低于檢測(cè)值（<0.2個(gè)細(xì)胞mL-1)。序列數(shù)據(jù)與此一致，只有11個(gè)與相關(guān)的讀數(shù)脫硫球莖在第103天，控制生物膜文庫(kù)中，而硫酸鹽生物膜文庫(kù)共有218個(gè)與SRB相關(guān)的讀數(shù)，其中168個(gè)（0.81%）與SRB相關(guān)。D.aespoeensis。硫酸鹽+ONKPVA6生物膜文庫(kù)同樣包含與SRB相關(guān)的211個(gè)讀數(shù)，其中43個(gè)與D.aespoeensis相關(guān)，22個(gè)與Desulfobacula OTU相關(guān)。中給出了SRB頻率豐度的詳細(xì)信息表7。

在硫酸鹽和甲烷梯度相反的情況下，地下微生物群落的多樣性受硫酸鹽控制——摘要、介紹

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