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材料和方法
來(lái)自葡萄園的漿果
漿果來(lái)源、葡萄樹(shù)齡、采樣時(shí)間和相應(yīng)測(cè)量的詳細(xì)信息列于表1中。來(lái)自Waite Campus（34°58'04.8'''S,138°38'07.9''''E）葡萄園的漿果在2014-2015、2015-2016和2016-2017季節(jié)采樣。成熟的設(shè)拉子、霞多麗和紅寶石無(wú)核葡萄藤在標(biāo)準(zhǔn)的葡萄園管理下生長(zhǎng)在自己的根上，垂直枝條定位，修剪枝條（兩個(gè)芽），在帶有頁(yè)巖碎片的深棕色粘土上滴灌，分級(jí)為紅棕色斑駁粘土;覆蓋在橄欖褐色斑駁的開(kāi)裂粘土上（Du Toit,2005）。行（3 m間距）是南北向的。三個(gè)重復(fù)每個(gè)由兩個(gè)葡萄藤組成，每個(gè)重復(fù)的設(shè)拉子和三個(gè)葡萄藤的霞多麗。在每個(gè)重復(fù)中標(biāo)記10個(gè)隨機(jī)簇（近端和遠(yuǎn)端的組合），每個(gè)重復(fù)在09:00之間的每個(gè)采樣日期在花梗-軸交界處用鋒利的剪刀切下20個(gè)漿果（每個(gè)簇中的兩個(gè)，隨機(jī)位于簇內(nèi)）小時(shí)和11點(diǎn)。紅寶石無(wú)核葡萄從三個(gè)葡萄藤中取樣，每個(gè)葡萄藤上有五個(gè)標(biāo)記用于取樣的簇，并且從每個(gè)葡萄藤中取樣20個(gè)漿果。漿果發(fā)育過(guò)程中的采樣時(shí)間以開(kāi)花后的天數(shù)來(lái)衡量（DAA，50%的花冠從花上掉下來(lái)）。漿果用密封塑料袋裝入冷卻容器中，帶回實(shí)驗(yàn)室，4℃避光保存，取樣后48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
表格1 漿果來(lái)源和性狀的總結(jié)
來(lái)自盆栽葡萄樹(shù)的漿果
Shiraz和Chardonnay扦插于2015年4月從Waite葡萄園采摘，并在4°C黑暗中儲(chǔ)存約2周后繁殖。繁殖方法和葡萄藤營(yíng)養(yǎng)管理基于Baby等人。(2014)。簡(jiǎn)而言之，在4°C冷室中的加熱沙床中開(kāi)始生根8周后，根長(zhǎng)達(dá)到~6 cm后，將插條轉(zhuǎn)移到12 cm盆中的蛭石:珍珠巖(1:1)混合物中.將花盆放置在具有16小時(shí)光周期、400μmol光子m的生長(zhǎng)室中–2 s–1)植物水平、27°C白天/22°C夜晚和50%濕度。用半強(qiáng)度的Hoagland溶液灌溉花盆（Baby等人，2014年）。在EL-12階段（葡萄藤Coombe，1995年）結(jié)果實(shí)的隨后被轉(zhuǎn)移到加州大學(xué)(UC)的土壤混合物中：61.5升沙子、38.5升泥炭苔蘚、50克氫氧化鈣、90克碳酸鈣和100克Nitrophoska®（12:5:1，N:P:K加微量元素；Incitec Pivot Fertilisers，南岸，維多利亞州，澳大利亞），每100升pH值為6.8，在20厘米直徑（4升）灌溉盆中之后用水。每個(gè)栽培品種的五個(gè)漿果（每個(gè)來(lái)自三個(gè)不同的葡萄樹(shù)）用于光學(xué)立體顯微鏡檢查。
霞多麗幼苗于2017年4月從Yalumba Nursery獲得，并用UC混合土壤種植在相同的生長(zhǎng)室中，生長(zhǎng)條件與上述相同。七株葡萄藤，每株一簇，用于O 2擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。
[氧氣 ]漿果中的輪廓
漿果[O 2]使用的克拉克型O 2尖端直徑為25μm微電極（OX-25；Unisense A/S，奧爾胡斯，丹麥）進(jìn)行測(cè)量。微電極在零O中校準(zhǔn)2溶液（0.1 M NaOH、0.1 MC 6 H 7 NaO 6）和充氣Milli-Q水（272μmol l）–1 22°C下為為100%O 2溶液。單個(gè)漿果（平衡至室溫）固定在電動(dòng)顯微操作臺(tái)上。為了幫助微電極穿透漿果皮膚，在漿果赤道處用不銹鋼注射器針頭(19 G)輕輕刺穿皮膚，深度為0.2毫米。微傳感器通過(guò)這個(gè)開(kāi)口被放置在漿果中，并且[O 2]分布是朝著漿果中心的深度采集的。對(duì)于設(shè)拉子，在皮下0.2毫米至1.5毫米處以0.1毫米的增量進(jìn)行測(cè)量。電極沒(méi)有移動(dòng)超過(guò)該點(diǎn)以避免損壞尖端對(duì)種子。對(duì)于不存在種子的Ruby Seedless和不存在種子或可通過(guò)半透明表皮確定種子位置的Chardonnay葡萄，從皮下0.2 mm到可以確定種子位置的間隔為0.5 mm進(jìn)行測(cè)量。漿果中心。每次測(cè)量在每個(gè)深度應(yīng)用10秒的持續(xù)時(shí)間。在每個(gè)位置之間，應(yīng)用了20秒的等待時(shí)間以確保穩(wěn)定的信號(hào)。為了測(cè)試針刺皮膚和插入微電極是否會(huì)被污染漿果內(nèi)部O 2周?chē)目諝?，在插入部位周?chē)胖靡粋€(gè)塑料環(huán)，并注入溫和流(250 ml min–1的氮?dú)?在獲得O同時(shí)將其施加到插入點(diǎn)2讀數(shù)的（圖1A）。將這些讀數(shù)與未施加氮?dú)獾淖x數(shù)進(jìn)行比較。
圖1
[O[O 2 2]霞多麗漿果（2016-2017年產(chǎn)季為90 DAA，Waite葡萄園）的]分布圖，使用和不使用N 2在測(cè)量過(guò)程中在入口點(diǎn)氣體進(jìn)行測(cè)量。插圖：用于測(cè)量漿果[O實(shí)驗(yàn)裝置2]剖面的（不按比例）。將O 2傳感器（尖端直徑25μm）插入漿果的赤道處，并大約穿過(guò)半徑向內(nèi)移動(dòng)到中心。在傳感器的入口周?chē)?，一個(gè)塑料環(huán)被密封并粘在漿果上，以容納輕輕流到傳感器入口點(diǎn)的氮?dú)狻?shù)據(jù)是平均值±SE，n=3。雙向方差分析（重復(fù)測(cè)量）顯示，深度占總變異的68.73%（P<0.0001），處理占總變異的0.55%（P=0.26），交互作用占總變異的3.72%（P=0.87）。
[O 2]霞多麗漿果（2016-2017季節(jié)的90 DAA，Waite葡萄園）的[O2]分布圖，在測(cè)量過(guò)程中在入口點(diǎn)使用和不使用N2氣體進(jìn)行測(cè)量。插圖：測(cè)量漿果[O2]剖面的實(shí)驗(yàn)裝置（不按比例）。將O2傳感器（尖端直徑25μm）插入漿果的赤道，然后向內(nèi)移動(dòng)到大約整個(gè)半徑的中心。在傳感器的入口周?chē)粋€(gè)塑料環(huán)被密封并粘在漿果上，以容納輕輕流到傳感器入口點(diǎn)的氮?dú)?。?shù)據(jù)是平均值±SE，n=3。雙向方差分析（重復(fù)測(cè)量）顯示，深度占總變異的68.73%（P<0.0001），處理占總變異的0.55%（P=0.26），交互作用占總變異的3.72%（P=0.87）。
O 2使用Unisense Suite軟件(Unisense A/S)記錄讀數(shù)。每個(gè)生物重復(fù)測(cè)量三個(gè)漿果。每個(gè)步驟的平均值和SE(n計(jì)算=3)并[O 2使用GraphPad Prism 7(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA,USA)編譯]分布。在O 2測(cè)量之后，使用帶有K型熱電偶珠探針（Fluke 80PK-1）的IR溫度計(jì)（Fluke 568，F(xiàn)luke Australia Pty Ltd，NSW，Australia）記錄漿果溫度。赤道的漿果直徑是用數(shù)字卡尺測(cè)量的。[O 2]和呼吸（見(jiàn)下文）在昏暗的房間照明下測(cè)量，<1μmol光子m–2 s–1。測(cè)定漿果活力（見(jiàn)下文），并使用數(shù)字折光儀（日本東京愛(ài)宕）作為漿果成熟度的指標(biāo)測(cè)定單個(gè)漿果汁液的總可溶性固形物(TSS)。
測(cè)試花梗皮孔的作用
[O 2]如上所述測(cè)量，但探針沿漿果中心軸固定在距花梗約2毫米處。獲得穩(wěn)定讀數(shù)后，N 2氣（250 ml min–1然后將）施加到花梗上，以測(cè)試花梗皮孔對(duì)O的貢獻(xiàn)2擴(kuò)散到漿果中。
漿果和種子呼吸O 2消耗
Clark型氧微傳感器OX-MR和MicroRespiration System(Unisense A/S)用于漿果和種子呼吸測(cè)量。一個(gè)復(fù)制品由九個(gè)漿果組成。測(cè)量室充滿(mǎn)充氣的MilliQ水，不斷攪拌，并在水浴中保持在25°C。在測(cè)量整個(gè)漿果的呼吸后，提取九個(gè)漿果的種子并使用相同的設(shè)備測(cè)量種子呼吸速率。室內(nèi)水[O 2監(jiān)測(cè)]的變化至少15分鐘，每5秒讀取一次讀數(shù)，以便根據(jù)[O下降的斜率確定穩(wěn)定的呼吸率2]。
還測(cè)量了設(shè)拉子和霞多麗漿果在用硅脂（SGM494硅脂，ACC Silicones Limited，Bridgewater，UK）覆蓋花梗之前和之后的呼吸作用，已知該硅脂會(huì)限制漿果花梗吸水（Becker等人，2012年）,在20°C和40°C。另一批九個(gè)霞多麗漿果用于確定切除花梗的呼吸作用。
漿果呼吸的溫度依賴(lài)性是通過(guò)保持在10、20、30和40°C的水浴來(lái)確定的。
花梗皮孔密度
使用帶CCD相機(jī)的Nikon SMZ 25立體顯微鏡（Nikon Instruments Inc.,Melville,NY,USA）評(píng)估霞多麗和設(shè)拉子漿果花梗（莖和容器）的皮孔密度。使用ImageJ（估計(jì)豆瓣面積(%)Schneider等人，2012年）通過(guò)首先調(diào)整圖像的顏色閾值以將花梗與背景分開(kāi)，然后將皮孔與花梗分開(kāi)來(lái)。隨后，使用感興趣區(qū)域(ROI)管理工具來(lái)估計(jì)花梗和皮孔的相對(duì)面積。
阻斷花梗皮孔的遠(yuǎn)期效果
在成熟開(kāi)始時(shí)（漿果軟化的最初跡象），每串生長(zhǎng)箱式霞多麗上大約一半漿果的花梗都覆蓋有硅脂。在施用后第3、5、7、10、12、14和18天，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中隨機(jī)取樣兩或三對(duì)漿果，每對(duì)含有來(lái)自一株植物的一個(gè)覆蓋和一個(gè)未覆蓋（對(duì)照）花梗.漿果[O 2]的分布如上測(cè)量，隨后評(píng)估漿果的細(xì)胞活力（見(jiàn)下文）。在有機(jī)硅應(yīng)用后12天和20天對(duì)三對(duì)漿果進(jìn)行取樣，并評(píng)估內(nèi)部乙醇濃度（見(jiàn)下文）。
漿果乙醇濃度
在液氮下將單個(gè)漿果研磨成細(xì)粉。按照制造商的說(shuō)明（Megazyme International Ireland Ltd,Wicklow,Ireland）使用乙醇測(cè)定試劑盒對(duì)乙醇進(jìn)行定量。簡(jiǎn)而言之，乙醇脫氫酶(ADH)催化乙醇氧化為乙醛。然后在醛脫氫酶(AL-DH)和NAD的存在下將乙醛進(jìn)一步氧化成乙酸和NADH+。在FLUOstar Omega讀板器（BMG LABTECH GmbH，Ortenbery，Germany）中在340 nm處測(cè)量NADH的形成。
果皮細(xì)胞活力評(píng)估
如詳細(xì)介紹的，使用熒光素二乙酸酯（FDA）染色程序?qū){果的切割內(nèi)側(cè)縱向表面進(jìn)行了Tilbrook和Tyerman（2008年）評(píng)估以及Fuentes等人。(2010)。使用MATLAB(Mathworks Inc.,Natick,MA,USA)代碼分析圖像以確定漿果細(xì)胞活力(Fuentes et al.,2010)。使用ImageJ，分析了赤道半徑上的FDA熒光信號(hào)。檢查了[O之間的相關(guān)性2]與霞多麗和紅寶石無(wú)核漿果內(nèi)相應(yīng)距離處熒光信號(hào)。也以這種方式分析了有或沒(méi)有花梗覆蓋的生長(zhǎng)室生長(zhǎng)的霞多麗漿果的熒光信號(hào)。
漿果內(nèi)的空氣空間
在2015-2016季節(jié)期間對(duì)霞多麗漿果進(jìn)行了micro-CT采樣，其中每個(gè)采樣時(shí)間使用三個(gè)漿果，每個(gè)漿果來(lái)自不同的重復(fù)。在A(yíng)delaide Microscopy的微型CT設(shè)備中使用Skyscan 1076（Bruker micro-CT，比利時(shí)Kontich）對(duì)葡萄進(jìn)行成像，其中整個(gè)漿果（附有花梗）具有59 kV、149μA、Al 0.5 mm的二維投影過(guò)濾器、2356 ms曝光、0.4°旋轉(zhuǎn)步長(zhǎng)和8.5μm像素大?。ㄏ喈?dāng)于15μm空間分辨率或3×10–6 mm 3體素大?。?。NRecon(bruker-microct.com)用于灰度圖像重建。使用CT-Analyer(bruker-microct.com)，將Otsu閾值應(yīng)用于體積，并應(yīng)用去斑以?xún)H接受超過(guò)500個(gè)體素的連續(xù)體積作為連接的空氣空間。使用CTVox(bruker-microct.com)生成內(nèi)部空氣空間的三維圖像；顯色模塊用于區(qū)分內(nèi)部空氣體積和漿果體積。然后將3-D模型縱向剖切以顯示內(nèi)部空氣空間分布。通過(guò)手動(dòng)選擇感興趣的體積并接受500個(gè)體素作為空氣空間，對(duì)漿果近端區(qū)域和種子頂部（種臍）之間的內(nèi)部孔隙度進(jìn)行定量分析。
統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±SE。雙向方差分析用于：O 2傳感器深度和施加N 2在傳感器入口處氣體對(duì)[O 2]的影響、O 2傳感器深度和成熟階段對(duì)[O 2]的影響、溫度和覆蓋皮孔對(duì)呼吸的影響、溫度和葡萄成熟度對(duì)呼吸Q 10的影響、覆蓋皮孔的影響和覆蓋持續(xù)時(shí)間對(duì)[O 2]、TSS、每個(gè)漿果的糖分、乙醇和活組織特征。Deming回歸用于確定FDA染色的熒光強(qiáng)度與[O之間的關(guān)聯(lián)2]；這種類(lèi)型的回歸考慮了的誤差x和y（Strike,1991）。t檢驗(yàn)用于以下方面的差異：兩個(gè)成熟階段霞多麗的漿果和種子的呼吸作用、霞多麗和設(shè)拉子之間花梗上的皮孔面積O活化能2的、霞多麗和設(shè)拉子漿果吸收，以及霞多麗的孔隙度和連通性指數(shù)兩個(gè)成熟階段。使用線(xiàn)性回歸確定皮孔覆蓋的漿果和對(duì)照漿果中CD的比率。
