背景介紹：組織工程技術(shù)的最新進展使研究人員能夠開發(fā)厚層組織結(jié)構(gòu)，然后將其移植應(yīng)用到再生治療中去。然而目前臨床應(yīng)用上，至關(guān)重要的是所植入的工程化組織在使用前是安全和功能化的。但是目前對厚層組織構(gòu)建的實時質(zhì)量評價的研究是有限的。本論文研究人員開發(fā)了一個關(guān)于工程組織活性進行定量化的系統(tǒng)，用于實時評估組織的相關(guān)性能。研究人員在對工程組織活性的評估是通過測量沿垂直軸方向的氧濃度以及應(yīng)用光學(xué)相干斷層掃描（OCT）獲得工程組織的橫斷面圖像來判斷工程組織的厚度，并應(yīng)用氧微電極技術(shù)獲得的培養(yǎng)的組織細胞的氧濃度，獲取關(guān)于與工程組織性能相關(guān)的三個重要的參數(shù)，并得出了一種關(guān)于生物工程組織的活性可以通過測量組織內(nèi)部的氧梯度來實時監(jiān)測的方法。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

使用尖端直徑為10微米的克拉克型氧微電極結(jié)合三維操作器測試了培養(yǎng)皿中層狀細胞目標(biāo)區(qū)域中的氧濃度，氧微電極是先直接插入培養(yǎng)皿表面的層狀細胞層中直至微電極尖端恰好接觸到培養(yǎng)皿底部后，然后使用自動三維操作器控制微電極向上移動10um并等待10分鐘，然后沿垂直軸方向測試培養(yǎng)皿中的溶解氧分布，其中微電極的每次測試間隔距離為為40毫米，直到微電極尖端從培養(yǎng)皿表面的培養(yǎng)基中露出來為止。

實驗結(jié)果

本論文研究開發(fā)了一個關(guān)于工程組織活性進行定量化的系統(tǒng)，從中實時評估工程組織的性能。工程組織活性的評估過程通過測量沿垂直軸方向的氧濃度以及應(yīng)用光學(xué)相干斷層掃描（OCT）獲得工程組織的橫斷面圖像來判斷工程組織的厚度。得到了工程組織上方的氧濃度，培養(yǎng)基質(zhì)中和工程組織上方區(qū)域的垂直軸上形成的氧梯度、組織內(nèi)部實時形成的氧梯度。其中組織內(nèi)部實時形成的氧梯度這個參數(shù)用于評價培養(yǎng)過程中工程組織的性能。這說明生物工程組織的活性可以通過測量組織內(nèi)部的氧梯度來實時監(jiān)測。所提出的測量策略可應(yīng)用于開發(fā)更有效的組織培養(yǎng)方法，并支持了厚工程組織的培養(yǎng)提供了實時確認定量的依據(jù)。

圖1、研究流程示意圖。圖(A)表示的是單個測試實驗的時間安排表。圖(B)表示的是應(yīng)用氧微電極測試培養(yǎng)的層狀細胞氧濃度剖面的測試方法。(C)測試一定厚度的含層狀細胞的氧剖面濃度確定的定三種參數(shù):POC(樣品中細胞周圍的氧濃度)、gradOxmedium(樣品中培養(yǎng)基中的氧梯度)gradOxytissuess(樣品中細胞組織的氧梯度)。圖(D)表示的是光學(xué)相干斷層掃描（OCT）系統(tǒng)獲得的橫斷層面截流動影像圖。

圖2、在正常培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細胞組織樣本在一次實驗中獲得的一個示例實驗數(shù)據(jù)集。并給出了在第0天(圖A所示)，第1天(圖B所示)和第5天(圖C所示)培養(yǎng)周期的三層的成肌細胞樣本測試數(shù)據(jù)。左邊的圖表示的是氧的剖面濃度分布。其中圖中顯示的氧氣濃度值的是與培養(yǎng)基與空氣界面處的氧濃度（Csat）的比值。一條垂直線表示的是層狀細胞和培養(yǎng)基之間的邊界。樣品組織的平均厚度就是顯示在這條線附近區(qū)域。圓括號中的數(shù)值表示層狀細胞內(nèi)的氧濃度與培養(yǎng)基與空氣界面處的氧濃度（Csat）的比值。右邊的圖顯示的是重組的組織樣本中心區(qū)域的3d圖像的側(cè)面和頂部視圖，應(yīng)用的是OCT系統(tǒng)獲得的橫斷層面影像圖。其中不同的空隙率值采用了不同的顏色表現(xiàn)出來。

圖3、在0-5天的培養(yǎng)過程中測量的細胞組織樣品厚度、細胞培養(yǎng)時間、細胞周圍氧濃度（POCs）之間的相關(guān)性實驗。其中圖(A)在正常培養(yǎng)皿上進行細胞培養(yǎng)；圖(B)在細胞培養(yǎng)池進行培養(yǎng)。其中圖中的第0天、第1天和第5天獲得的數(shù)據(jù)分別采用三角形、正方形及×形表示以便區(qū)分。

圖4、在單個實驗中使用細胞池培養(yǎng)的樣本獲得的數(shù)據(jù)。本論文中的實驗數(shù)據(jù)案例是在(A)第0天、(B)第1天和(C)第5天的三層成肌細胞樣本中獲得的數(shù)據(jù)。其中左邊左邊的圖表示的是氧的剖面濃度分布，右邊的圖表示的是采用了OCT系統(tǒng)獲得的橫斷層面影像圖。其中不同的空隙率值采用了不同的顏色表現(xiàn)出來。圓括號中的數(shù)值表示層狀細胞內(nèi)的氧濃度與培養(yǎng)基與空氣界面處的氧濃度（Csat）的比值。

圖5、提出用葡萄糖消耗率來評價層狀細胞的活力指數(shù)。其中圖(A-C)表示的是培養(yǎng)單、雙、三層的細胞組織所需的葡萄糖消耗速率。其中的細胞組織的培養(yǎng)是正常的培養(yǎng)皿(●)或細胞池(□)上培養(yǎng)。圖中的所獲得的實驗點是根據(jù)測量所用的時間間隔繪制的。圖(D-F)表示的△GCR指數(shù)定義為DGCRDay 4-5-GCR Day 0-1]/GCR Day0-1，其中的獲取的數(shù)據(jù)是分別從單層、雙層和三層細胞組織中獲得的，橫坐標(biāo)表的是在正常的培養(yǎng)皿中和在細胞池中進行培養(yǎng)的方法。

結(jié)論與展望

為了恢復(fù)受損組織和器官的功能，研究人員首次提出關(guān)于將功能細胞移植到受損組織中的技術(shù)方案。移植細胞被認為可以分泌細胞因子和趨化因子，從而誘導(dǎo)血管生成抗纖維化，抗凋亡，并將干細胞植入受損組織。隨著研究人員對厚組織的臨床應(yīng)用研究的不斷深入，厚組織的臨床應(yīng)用也越來越多重要，但是移植的厚結(jié)構(gòu)組織在使用前需要了解其是否安全有效，目前對于這一類的研究報道較少。本論文研究人員開發(fā)一種實時測量氧濃度的系統(tǒng)方法，研究人員在評價組織的性能時采用了unisense公司生產(chǎn)的克拉克型氧氣微電極，該微電極可以實現(xiàn)對于組織細胞培養(yǎng)環(huán)境中關(guān)于細胞組織上方的氧濃度、培養(yǎng)基質(zhì)中和工程細胞組織上方區(qū)域的垂直軸上形成的氧梯度以及細胞組織內(nèi)部實時形成的氧梯度測試。獲取的這三個重要的氧濃度參數(shù)對于判斷工程細胞組織的活性及組織的功能化的非常重要，這也意味著生物工程組織的活性是可以通過測量組織內(nèi)部的氧梯度來實時監(jiān)測完成的。這種測量策略的提出為今后的在厚工程組織的培養(yǎng)提供了實時確認定量的方法。這也另一個側(cè)面說明了丹麥Unisense公司開發(fā)的克拉克型氧微電極在移植細胞培養(yǎng)工程學(xué)領(lǐng)域方面存在非常好的應(yīng)用前景。