研究簡介：木質(zhì)纖維素(cellulose)是由葡萄糖組成的大分子多糖。不溶于水及一般有機溶劑。甲殼動物蛀木水虱危害木船和碼頭木質(zhì)設(shè)施，俗稱“吃木蟲”。研究發(fā)現(xiàn)蛀木水虱有一定的益處，其體內(nèi)含有一種特殊的酶，有助于將木頭分解為生物能源。蛀木水虱體內(nèi)并沒有幫助消化木質(zhì)的微生物，研究人員發(fā)現(xiàn)完全靠自己將木質(zhì)纖維素分解為糖分。本論文主要就甲殼動物蛀木水虱中存在的血液蛋白酶如如何實現(xiàn)對木質(zhì)纖維素的消化，了解其體內(nèi)存在的蛋白酶對纖維素水解的機理，從而將有助于科學(xué)家們設(shè)計出更強大的酶用于工業(yè)生產(chǎn)。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

unisense公司的pH電極和氧氣微電極應(yīng)用于動物腸道內(nèi)的pH測試及氧濃度的測試。實驗過程中，蛀木水虱用針刺頭和針固定在瓊脂糖板上(上覆有海水)。在鑷子的幫助下，切除蛀木水虱胸椎節(jié)段，露出了蛀木水虱后腸，使用尖端直徑為25μm的pH值微電極和尖端直徑為10μm氧氣微電極(Unisense、丹麥)對蛀木水虱的上腸腔到后腸腔內(nèi)的氧氣和pH進(jìn)行了測試。傳感器尖端被引入信號穩(wěn)定后記錄下腸組織內(nèi)部不同區(qū)域的pH值和氧濃度值。

實驗結(jié)果

木質(zhì)(木質(zhì)纖維素)植物是一種豐富的可再生原料，富含多糖與木質(zhì)素結(jié)合成不溶性纖維的復(fù)合材料。海洋甲殼類動物林棲動物屬的伐木工是少數(shù)能以這種食物為生而不依賴腸道寄生菌群的動物之一。糞便顆粒分析說明蛀木水虱以含己糖的多糖(主要是纖維素)為目標(biāo)與消化系統(tǒng)中纖維素酶的豐富程度相對應(yīng)，但是木蘭和木質(zhì)素基本未被消耗。研究證明了蛀木水虱的呼吸蛋白，血藍(lán)蛋白，在木材被消化的后腸中含量豐富，與木材一起孵育血藍(lán)蛋白通過纖維素酶顯著提高其消化率，并對木質(zhì)素進(jìn)行了修飾。我們提示血藍(lán)蛋白的這種活性對蛀木水虱的攝食能力是有幫助的沒有腸道共生體的木材。這些發(fā)現(xiàn)可能會帶來創(chuàng)新木質(zhì)纖維素生物煉制。

圖1、柳樹木主要生物高分子組成成分的消化前后。圖a表示的是蛀木水虱的糞便顆粒掃描電鏡(尺寸-50μm)。b從木材(柳樹，N=10)和糞球(糞便78%，為消化過程中的質(zhì)量損失，N=8）組分包括乙酰溴化的可溶性木質(zhì)素(藍(lán)色)、TFA-可溶性半纖維素(紅色)和硫酸酸性的可溶性纖維素(橙色)。圖c表示的是木材纖維素組分消化前(柳樹,N=11;(暗橙色)的單糖組成(絕對含量）和消化后(糞便78%，消化過程中歸一化的質(zhì)量損失，N=8;淡橙色)在使用三氟乙酸（TFA）水解后，連續(xù)H2SO4水解進(jìn)行的分析。d木材半纖維素組分單糖組成(絕對含量)(柳樹N=11;消化后(糞便78%，歸一化為消化過程質(zhì)量損失，N=10;淡紅色)TFA水解分析。圓圈表示樣本值。Fuc,海藻糖,Ara,阿拉伯糖;Rha,鼠李糖;半乳糖;Glu、葡萄糖;Xyl,木糖;,甘露糖;GalA,半乳糖醛酸。

圖2、蛀木水虱的消化系統(tǒng)組成示意圖。圖a表示的是蛀木水虱側(cè)面示意圖(通常2-3mm長)，圖中顯示兩個雙葉肝胰酶(Hp)中的一個，連接了管狀腸的前部;流形(M)和過濾系后統(tǒng)(FS)位置如圖所示，后腸部分食物質(zhì)量為暗色，腸道不同測量位置點的pH值。B腸道的幾丁質(zhì)角質(zhì)層內(nèi)襯的掃描電子顯微照片(比例尺寸、5μm)。圖C表示的是脾肝胰腺細(xì)胞微絨毛(Mv)的肝胰腺內(nèi)腔的透射電子顯微照片(比例尺寸,2μm)。圖D表示的是應(yīng)用微電極測試蛀木水虱后腸(腸)區(qū)域，蛀木水虱身體區(qū)域及進(jìn)入周圍加入的海水中的氧濃度(尺寸的規(guī)模0.5 mm)。

圖3、蛀木水虱消化過程蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和天然血青素提取物。圖a表示的是蛀木水虱后腸液中糖基水解酶(GH)家族相對豐度的測定。圖b表示的是蛀木水虱的后腸血青蛋白相對豐度通過血青蛋白相對摩爾百分比的比較，分為組織(包括固體含量)和液體部分。圖c表示的是從蛀木水虱克隆的GH家族5、7、9各2個成員的相對基因表達(dá)差異。圖d表示的是蛀木水虱內(nèi)的4個血青蛋白基因的相對表達(dá)差異。圖e表示的是蛀木水虱體內(nèi)的血藍(lán)蛋白的凝膠（SDS-PAGE）電泳圖。圖f表示的是經(jīng)陰性醋酸鈾酰染色的天然蛀木水虱中血藍(lán)蛋白的提取物的TEM圖像顯示。

圖4、焦糖醇和分離木質(zhì)素的血青苷活性。圖a表示的是變色菌屬蟲漆酶與活化的在以NaPO4、pH為6.8，含有1nm的焦棓酸培養(yǎng)孵化的血藍(lán)蛋白的紫外-可見光譜圖。圖b表示的是堿木質(zhì)素(3%)在海水(SW，黑色)或含血藍(lán)蛋白(Hc，紅色）經(jīng)1h孵育后的13C固相核磁共振13C譜圖。

圖5、室溫下短血藍(lán)蛋白預(yù)處理后楊柳樹木的消化率。其中楊柳消化率測定采用的是生物量預(yù)處理糖化反應(yīng)中每單位生物量釋放纖維二糖(nmol)的量(mg)。預(yù)處理包括在海上中對血藍(lán)蛋白的預(yù)處理（Hc暗紅色）、單獨的海水處理（SE淡藍(lán)色）、沒有處理（藍(lán)色）和使用了50mM DTPA（螯合劑）處理（淡紅色）。圖b表示的是應(yīng)用CBH I進(jìn)行糖化后的紅褐肉座菌(HjCBHI)。水解產(chǎn)物是根據(jù)分析HPAEC中纖維低聚物標(biāo)準(zhǔn)。所獲得的數(shù)值是對預(yù)處理后沒有CBH的反應(yīng)進(jìn)行歸一化，來反映血青苷的制備過程中剩余的纖維素酶活性。

結(jié)論與展望

英國約克大學(xué)、樸次茅斯大學(xué)以及美國國家可再生能源實驗室的科學(xué)家使用先進(jìn)的生物化學(xué)分析方法和微電極技術(shù)，找出了蛀木水虱體內(nèi)能分解木頭的酶并揭示了其結(jié)構(gòu)和功能。在研究過程中，研究人員為了充分了解蛀木水虱體內(nèi)蛋白酶分解木質(zhì)纖維素的的機理，應(yīng)用unisense公司的氧氣及pH微電極成功實現(xiàn)了對甲殼動物蛀木水虱體內(nèi)的腸道組織內(nèi)的氧氣及pH實現(xiàn)了原位的測試，由于該微電極具有空間精度高（尖端直徑為25um或10um）、測試相應(yīng)速度快（2s），很好的幫助科研人員對活體的甲殼動物蛀木水虱體內(nèi)的相關(guān)環(huán)境（pH/氧濃度等）進(jìn)行了原位測試，從而更好的了解蛀木水虱體內(nèi)存在的這種分解木質(zhì)纖維素酶的工作原理，很好的揭示了其結(jié)構(gòu)和功能，成功的揭示了纖維素鏈如何被消化成葡萄糖。該研究結(jié)果將有助于科學(xué)家們設(shè)計出更強大的酶用于工業(yè)生產(chǎn)，這說明微電極在研究關(guān)于地將廢紙、舊木材和稻草等廢物變成液體生物燃料領(lǐng)域存在很好的應(yīng)用前景。