背景介紹：研究表明細(xì)胞在培養(yǎng)和組織中也可能對(duì)更為溫和缺氧環(huán)境作出反應(yīng)，通過(guò)復(fù)雜的基因調(diào)控反應(yīng)也包括選擇性激活，而這些基因大多數(shù)受到缺氧反應(yīng)因子的影響。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中控制細(xì)胞外圍的氧分壓通常是通過(guò)修復(fù)細(xì)胞培養(yǎng)上方的氣相介質(zhì)中的氧分壓，然而細(xì)胞外圍的氧分壓還取決于培養(yǎng)基是否攪拌，細(xì)胞的數(shù)量和他們的代謝率在一個(gè)特定培養(yǎng)環(huán)境中以及擴(kuò)散介質(zhì)表面到瓶底的距離，本論文的的研究人員采用了一種新的檢測(cè)的手段（unisense）實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞周圍氧張力檢測(cè)，以及對(duì)個(gè)別細(xì)胞集落的局部效應(yīng)的氧分壓的監(jiān)測(cè)成為可能。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

應(yīng)用了克拉克型的Unisense氧氣微電極（尖端直徑為10um）測(cè)試了培養(yǎng)基環(huán)境中的細(xì)胞周圍的氧分壓，其中所研究的培養(yǎng)物放置在人工操作的顯微鏡上并置于培養(yǎng)箱內(nèi)。所有的測(cè)量都在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，氧微電極以30度角度插入到培養(yǎng)基環(huán)境中對(duì)細(xì)胞周圍的氧分壓進(jìn)行測(cè)試。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

研究表明盡管暴露于環(huán)境空氣的氧分壓下，傳統(tǒng)的貼壁細(xì)胞在進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)可能會(huì)經(jīng)歷細(xì)胞周圍氧分壓低于維持充分氧化代謝所需的水平。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，消耗氧的報(bào)告的更明顯，細(xì)胞培養(yǎng)是在氧分壓降低的情況下培養(yǎng)的(降低到4%左右的氧)。研究結(jié)果說(shuō)明，如果不測(cè)量培養(yǎng)細(xì)胞周圍的氧分壓，是不可能的與體外培養(yǎng)結(jié)果聯(lián)系起來(lái)的(例如基因表達(dá)與氧分壓有關(guān)細(xì)胞所表達(dá)的)，而這一濃度可能會(huì)大大偏離記錄在氣相中的氧濃度。

圖1、在培養(yǎng)箱內(nèi)測(cè)量氧分壓的裝置顯示。氧微電極傳感器安裝在倒置的奧林巴斯CK41顯微鏡上，微電極使用了微操作控制臺(tái)進(jìn)行控制。

圖2、研究了氧微電極傳感器在皮安表中對(duì)應(yīng)的線性響應(yīng)隨傳感器尖端周圍氧分壓的變化規(guī)律

圖3、常規(guī)培養(yǎng)的T-47D細(xì)胞對(duì)應(yīng)的氧分壓曲線(即氧分壓與瓶底以上高度距離的函數(shù)圖)。在第0天，每個(gè)燒瓶接種5×106或102個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞環(huán)境中為含5%二氧化碳的大氣。圖中的符號(hào)○□△◇分別代表的是1-、2-、3-和培養(yǎng)4天的培養(yǎng)基中的氧濃度剖面圖，每瓶對(duì)應(yīng)的是0.5×106個(gè)細(xì)胞，第0天接種時(shí)，所有這些剖面圖都表示的是測(cè)量的尖端直接落在菌落的頂部的測(cè)量值。然而，對(duì)于3天和4天的細(xì)胞培養(yǎng)物，獲得的數(shù)據(jù)是微電極的測(cè)量尖端與菌落之間的結(jié)束位置。如(b)所示,分別培養(yǎng)4天和7天，每個(gè)燒瓶接種106個(gè)細(xì)胞。

圖4、第7天培養(yǎng)T-47D細(xì)胞。每個(gè)燒瓶接種106個(gè)細(xì)胞，在含氧濃度為19%的體系中生長(zhǎng)。

圖5、表面底部氧分壓差值對(duì)應(yīng)5×105細(xì)胞/培養(yǎng)皿接種時(shí)間的函數(shù)圖。第7天培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞周圍的氧分壓低于缺氧呼吸水平(1.3%)。開(kāi)放的圓圈表示細(xì)胞在含4%氧氣的環(huán)境中生長(zhǎng)，封閉的圓圈表示含19%氧氣的環(huán)境中生長(zhǎng)。

總結(jié)

細(xì)胞正常培養(yǎng)的過(guò)程中，盡管可通過(guò)在氣相中環(huán)境中控制培養(yǎng)環(huán)境中高而恒定的氧氣濃度，但是細(xì)胞周圍的氧分壓的會(huì)隨著培養(yǎng)的進(jìn)行會(huì)急劇的降低，因此每個(gè)細(xì)胞耗氧量由培養(yǎng)基中氧分壓曲線計(jì)算獲得的。研究人員發(fā)現(xiàn)某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)時(shí)，氧分壓程度存在重要差異。氧在細(xì)胞培養(yǎng)基中的擴(kuò)散速率較低，由于正常的呼吸作用，氧分壓的降低通常在細(xì)胞附近發(fā)生。因此為了標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化，監(jiān)測(cè)細(xì)胞周圍的氧分壓和細(xì)胞的耗氧量非常重要。

研究人員首次應(yīng)用了丹麥unisense公司集成的氧微電極系統(tǒng)，該套系統(tǒng)（unisense微剖面分析系統(tǒng)）使用的是克拉克型的微電極與皮安表結(jié)合使用，在顯微鏡的配合下可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周圍的氧濃度分壓的在線監(jiān)測(cè)，由于使用的電極的尖端非常細(xì)（5um-500um之間，）可進(jìn)入穿刺入到覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)層處1.6毫米深的介質(zhì)層區(qū)域測(cè)試垂直橫斷面區(qū)域的氧濃度剖面，獲得相關(guān)的氧濃度剖面數(shù)據(jù)對(duì)于研究人員分析細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的耗氧提供了重要的數(shù)據(jù)支持，為研究人員在相應(yīng)的細(xì)胞或組織培養(yǎng)方案中提供重要的理論指導(dǎo)，這說(shuō)明unisense這套剖面分析系統(tǒng)在細(xì)胞培養(yǎng)等領(lǐng)域存在很好的應(yīng)用前景。