在自然界中，細(xì)菌常以細(xì)菌生物膜的形式存在，其形成給公共衛(wèi)生、醫(yī)療、環(huán)境等關(guān)乎國(guó)計(jì)民生的重要領(lǐng)域帶來(lái)了諸多不利影響。開(kāi)發(fā)細(xì)菌生物膜的高效檢測(cè)方法、探究細(xì)菌生物膜形成與細(xì)菌群體感應(yīng)(QS)調(diào)控的內(nèi)在聯(lián)系，尋找抑制細(xì)菌生物膜形成的有效策略，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。本論文針對(duì)細(xì)菌生物膜實(shí)時(shí)原位監(jiān)測(cè)、細(xì)菌生物膜QS現(xiàn)象實(shí)時(shí)追蹤的研究需求，研制了集成熒光、電阻抗、SERS各種檢測(cè)功能的光電傳感檢測(cè)芯片。通過(guò)在芯片上構(gòu)建細(xì)菌生物膜生長(zhǎng)微環(huán)境，利用建立的光電傳感芯片分析檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生物膜生長(zhǎng)狀態(tài)、形成周期規(guī)律、分泌QS信號(hào)分子動(dòng)態(tài)變化過(guò)程的原位、實(shí)時(shí)、在線(xiàn)監(jiān)測(cè)與高效分析，進(jìn)一步探究了傳統(tǒng)抗生素、中藥活性組分、納米抗菌材料多種類(lèi)型抗菌藥物對(duì)細(xì)菌生物膜形成及QS信號(hào)分子分泌的影響。

本文主要研究工作及結(jié)果如下:

(1)微流控芯片上Tannin-Ag NPs抑制大腸桿菌生物膜過(guò)程的原位熒光觀測(cè)設(shè)計(jì)制備了用于細(xì)菌生物膜實(shí)時(shí)熒光觀測(cè)及檢測(cè)的多通道微腔陣列PDMS-玻璃復(fù)合芯片，建立了細(xì)菌生物膜可視化熒光分析檢測(cè)方法。制備了平均粒徑為42.37nm的中藥活性組分單寧酸與納米銀的復(fù)合納米抗菌材料—單寧酸修飾納米銀(Tannin-Ag NPs)，其對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為16μg/m L。在芯片上通過(guò)實(shí)時(shí)熒光觀測(cè)及熒光定量檢測(cè)，考察了Tannin-Ag NPs對(duì)大腸桿菌生物膜形成過(guò)程的抑制效果。結(jié)果表明，1/2MIC的Tannin-Ag NPs強(qiáng)烈地抑制了大腸桿菌生物膜形成，抑制作用強(qiáng)于相同濃度的單寧酸和Ag NPs。Tannin-Ag NPs改變了大腸桿菌生物膜形成的固有周期，使芯片中大腸桿菌生物膜生長(zhǎng)期由15 h縮短至9 h。

(2)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌生物膜形成過(guò)程的原位無(wú)損電阻抗芯片傳感監(jiān)測(cè)設(shè)計(jì)制備了集成叉指微電極的電阻抗傳感芯片，建立了區(qū)分大腸桿菌和沙門(mén)氏菌生物膜形成過(guò)程周期節(jié)點(diǎn)的阻抗分析方法。利用集成在芯片底部的叉指金微電極，以100 m V的擾動(dòng)電壓，在1～100 KHz的頻率范圍內(nèi)，對(duì)這兩種細(xì)菌生物膜在芯片中的生長(zhǎng)變化過(guò)程進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)48 h的原位阻抗監(jiān)測(cè)。采用包含生物膜電容C_b及生物膜電阻R_b等關(guān)鍵參數(shù)的等效電路分析模型，解析了這兩種細(xì)菌生物膜的阻抗譜圖。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，C_b呈先下降后上升的趨勢(shì)，而R_b卻呈現(xiàn)出與C_b相反的變化趨勢(shì)，這與細(xì)菌完成電極表面粘附并逐漸形成成熟生物膜，直到細(xì)菌生物膜出現(xiàn)散播的變化過(guò)程密切相關(guān)。此外，沙門(mén)氏菌及大腸桿菌的C_b及R_b發(fā)生改變的時(shí)間節(jié)點(diǎn)存在差異，可通過(guò)阻抗檢測(cè)方法對(duì)這兩種細(xì)菌生物膜形成過(guò)程進(jìn)行區(qū)分。最后，采用結(jié)晶紫染色法證實(shí)了阻抗傳感芯片分析方法解析細(xì)菌生物膜形成過(guò)程的正確性。

(3)銅綠假單胞菌生物膜形成過(guò)程中電活性QS信號(hào)分子的芯片傳感監(jiān)測(cè)。設(shè)計(jì)制備了用于銅綠假單胞菌生物膜形成過(guò)程中分泌綠膿菌素原位、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的電化學(xué)傳感芯片。在芯片上集成了由工作電極、參比電極和對(duì)電極組成的微電極陣列。采用電化學(xué)沉積法在工作電極表面修飾了粒徑大約為100 nm的納米金顆粒。電化學(xué)傳感芯片對(duì)綠膿菌素檢測(cè)限低至100 n M，在100 n M～200μM范圍內(nèi)綠膿菌素濃度與峰電流呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R~2=0.9997。在芯片上對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成過(guò)程中產(chǎn)生的綠膿菌素進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)72 h的電化學(xué)監(jiān)測(cè)。結(jié)果表明，在銅綠假單胞菌生物膜早期粘附期，綠膿菌素濃度低于1μM，處于較低水平;在生物膜生長(zhǎng)期，綠膿菌素濃度迅速增加，可增至100μM以上;在生物膜散播期，綠膿菌素濃度又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。同時(shí)，研究了中藥活性組分姜黃素對(duì)銅綠假單胞菌生物膜分泌綠膿菌素的影響，發(fā)現(xiàn)低于MIC的姜黃素可顯著降低綠膿菌素產(chǎn)生水平，最大濃度可降低至38.4μM。

(4)不同抗菌藥物與銅綠假單胞菌生物膜相互作用過(guò)程的SERS芯片檢測(cè)和解析。設(shè)計(jì)制備了用于實(shí)時(shí)原位監(jiān)測(cè)不同抗菌藥物與銅綠假單胞菌生物膜相互作用過(guò)程的微腔陣列SERS芯片。采用化學(xué)自組裝技術(shù)，在芯片中集成了均一性、穩(wěn)定性良好的納米銀SERS基底，分析增強(qiáng)因子可達(dá)1.84×10~8，大大增強(qiáng)了銅綠假單胞菌生物膜拉曼信號(hào)，對(duì)QS信號(hào)分子綠膿菌素檢測(cè)限低至10~(-9)mol/L。利用SERS技術(shù)對(duì)銅綠假單胞菌與頭孢他啶、中藥活性組分姜黃素和單寧酸三種不同抗菌藥物的相互作用過(guò)程進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)72 h的無(wú)損、原位SERS監(jiān)測(cè)。結(jié)果顯示，在0～12 h內(nèi)，650 cm~(-1)、728 cm~(-1)位置處拉曼峰強(qiáng)度逐漸增加，銅綠假單胞菌生物膜生長(zhǎng)活躍;在24～36 h內(nèi)，1350 cm~(-1)位置處綠膿菌素拉曼峰強(qiáng)度很高，產(chǎn)生綠膿菌素QS信號(hào)分子;36～72 h后，1350 cm~(-1)位置處綠膿菌素拉曼峰強(qiáng)度降低，其濃度逐漸下降。頭孢他啶、姜黃素、單寧酸對(duì)銅綠假單胞菌生物膜生長(zhǎng)及綠膿菌素抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)轭^孢他啶姜黃素單寧酸。進(jìn)一步，采用質(zhì)譜法對(duì)SERS芯片監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，表明該SERS芯片及其分析檢測(cè)方法能成功用于研究細(xì)菌生物膜與抗菌藥物的相互作用過(guò)程。