深海水域的微生物氧呼吸具有重要的生態(tài)學(xué)意義，但人們對(duì)其研究甚少，主要是方法上的困難較多。尤其是微生物的呼吸測(cè)量是具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)樾枰叻直媛实难鯕鉂舛葴y(cè)量設(shè)備。最近關(guān)于氧傳感技術(shù)（丹麥unisense研發(fā)的微電極技術(shù)）的改進(jìn)克服當(dāng)下研究這些問題的局限性具有很大的潛力。本論文的研究人員主要比較了三種不同的方法來測(cè)量低氧濃度下的耗氧量，利用克拉克型氧傳感器(STOX)，光學(xué)氧傳感器(optodes)，質(zhì)譜結(jié)合18-18O2標(biāo)記法。研究人員通過在不同的方法中，以及同樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)置中，對(duì)比研究三種方法的氧濃度和耗氧量一致性評(píng)價(jià)，并采用高耗氧量法測(cè)定了30-400 nmol L-1h-1的耗氧量精度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差。

Unisense微電極測(cè)量系統(tǒng)的的應(yīng)用

unisense公司的氧氣微電極(STOX)應(yīng)用于水生生物的氧的消耗及消耗速率的測(cè)試。STOX氧氣微電極采用傳統(tǒng)的兩點(diǎn)法進(jìn)行矯正，研究過程中將STOX型微電極插入到特制的玻璃瓶中，測(cè)試玻璃品的水生生物的耗氧速率，并同步采用光學(xué)氧傳感法及質(zhì)譜法測(cè)試含有水生生物的玻璃瓶中的氧的消耗速率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)所有方法均適用于O2消耗量的檢測(cè)，反應(yīng)速率在幾個(gè)nmol L-1h-1和低濃度O2的范圍內(nèi)，研究結(jié)果測(cè)試出了海洋環(huán)境下的海洋生物預(yù)期的氧的消耗速率。其中氧的消耗速率的具體限制需要控制如微電極傳感器的漂移(STOX)和氧的污染(Exetainer)的最小化以達(dá)到低檢測(cè)限，并充分利用傳感器帶來的特定精度和測(cè)量頻率。潛在檢測(cè)限為24小時(shí)潛伏期為幾個(gè)nmol L-1h-1或更少，但各有差異的方法。對(duì)于連續(xù)測(cè)量和極低的氧消耗速率，推薦使用STOX傳感器（unisense微電極）和光電法。研究發(fā)現(xiàn)在低氧濃度下培養(yǎng)是一個(gè)特殊的挑戰(zhàn)，比如聚集體的存在是否可以限制擴(kuò)散速率預(yù)期濃度低于20umol L-1，并要考慮有限的氧氣消耗的本身擴(kuò)散，樣品需要更加精細(xì)化的處理，以便更好地在原位條件下繁殖并考慮到其聚合體的大小和分布。

圖1、實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)裝置圖。孵育瓶置于恒溫水浴中。兩個(gè)光學(xué)氧傳感器被放置在瓶的上半部分相對(duì)的兩側(cè)。該STOX傳感器是通過一個(gè)玻璃管插入瓶的中心。校正的過程是通過壓力補(bǔ)償口加入已知的空氣飽和量的水。容器下方通過磁力攪拌器旋轉(zhuǎn)。

圖2、水培養(yǎng)瓶用18O2標(biāo)記。標(biāo)記的水以0.73 mL min-1的流量泵出瓶子的薄膜入口穿過質(zhì)譜儀。水是通過一個(gè)氣密袋中脫去無標(biāo)記氧的水后定位在上邊緣的壓力進(jìn)入取而代之。氦氣作為載體氣體，具有質(zhì)量穩(wěn)定、速度快的特點(diǎn)。

圖3、實(shí)驗(yàn)1:光學(xué)氧傳感器和全量程光學(xué)氧傳感器(全范圍)和STOX傳感器測(cè)試體系中的氧濃度的示意圖。脫氣水依次富集，通過加入已知體積的飽和空氣水(箭頭)來補(bǔ)充氧氣。消耗率計(jì)算后，增加的O2隨時(shí)間減少。30小時(shí)后加入ZnCl2停止生物活性。插圖表示的是在最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)的光電子初始適應(yīng)情況。

圖4、對(duì)比幾種測(cè)試方法氧氣隨時(shí)間的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用光電子和STOX傳感器測(cè)量氧氣消耗速率，調(diào)節(jié)O2濃度為1.2 umol L-1(A)、5.5 umol L-1(B)、umol L-1(C)，加入20ml ZnCl2后圖(D)，線性擬合用直線表示。其中時(shí)間和濃度軸的縱橫比(umol L-1 h-1)對(duì)于所有允許的圖形都是相同的坡度上進(jìn)行比較的。

圖5、比較膜入口質(zhì)譜法（MIMS）和安培電流法（STOX）傳感器（unisense氧微電極）。O2的濃度和消耗率測(cè)量后，添加1.2 umol 18-18O2 L-1(圖A箭頭所示.單個(gè)MIMS法的測(cè)量值(灰色點(diǎn))取平均值(黑點(diǎn))，并用相應(yīng)的點(diǎn)表示標(biāo)準(zhǔn)差。整個(gè)實(shí)驗(yàn)運(yùn)行3小時(shí)同時(shí)測(cè)量。(B)用于氧的消耗速率計(jì)算。

表1、三種不同方式測(cè)量的氧的耗速率、方法設(shè)置和統(tǒng)計(jì)。表1中總結(jié)了不同O2濃度(O2)、不同傳感器和采樣頻率下測(cè)量的O2消耗耗率。由式(1)和式(2)計(jì)算各速率測(cè)量值、標(biāo)準(zhǔn)差(SE)和殘差均方根(RMSRES)及潛在的檢出率極限，假設(shè)培養(yǎng)24小時(shí)由公式3計(jì)算。請(qǐng)注意較低的RMSRES表示較高的精度和潛在的速率檢測(cè)限制只基于精度和測(cè)量頻率，而不考慮傳感器漂移或O2污染帶來的可能限制。

圖6、耗氧速率與O2濃度的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)2、實(shí)驗(yàn)3的耗氧量被總結(jié)并繪制在各自孵育的初始O2濃度上。實(shí)驗(yàn)3中的虛線表示由公式4估算出的擴(kuò)散極限速率，假設(shè)總直徑(r0)為0.14 mm。其中實(shí)驗(yàn)1的獲得的氧消耗速率也隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，同時(shí)也能反映細(xì)菌隨時(shí)間的增長(zhǎng)。

表2、不同測(cè)試方法在精度、檢出限和適用性方面進(jìn)行比較圖。表中的評(píng)級(jí)方案采用符號(hào)表示:正常(+)、強(qiáng)(++)和非常強(qiáng)(+++)。同時(shí)比較了傳感器的易損性、現(xiàn)場(chǎng)操作性和易損件的價(jià)格對(duì)比情況。

總結(jié)

由于深海屬于的微生物的氧呼吸具有重要的生態(tài)學(xué)意義，因此研究人員需要找到一種測(cè)試方法能夠準(zhǔn)確的測(cè)試出深海水域的微生物的呼吸速率，由于微生物的氧呼吸的濃度特別低，因此需要具有高分辨率的氧濃度測(cè)試設(shè)備，并且其檢測(cè)限能夠達(dá)到nmol/L，這對(duì)于設(shè)備的要求非常高，而丹麥unisense公司開發(fā)的氧微電極能夠很好的完成這些測(cè)試，研究人員為了能夠獲得海水中微生物的氧的消耗速率的準(zhǔn)確性，同步使用了光學(xué)氧傳感器以及質(zhì)譜法來同步驗(yàn)證，對(duì)于連續(xù)測(cè)量和極低的氧消耗速率，推薦使用STOX傳感器（unisense微電極）和光學(xué)氧傳感器，而相比于光學(xué)氧傳感器，STOX傳感器的使用成本較低，非常適合研究人員應(yīng)用與微生物的氧消耗測(cè)試，并且相比于其他方法，也具有較高的精度，尤其是在低氧濃度下培養(yǎng)的微生物的呼吸速率的測(cè)試，因?yàn)檫@些微生物的聚集體的存在是存在一定的擴(kuò)散速率，需要考慮的擴(kuò)散限制氧氣消耗情況，而unisense微電極具有測(cè)試速度響應(yīng)快、受氧氣擴(kuò)散消耗的影響小等優(yōu)點(diǎn)，可以在原位條件實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的氧呼吸速率的測(cè)試，這也說明unisense微電極在低氧濃度的海洋環(huán)境中的水生生物的呼吸速率的測(cè)試具有非常好的應(yīng)用前景。