間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞家族的重要成員，具有高度增殖、自我更新能力，廣泛分布于骨髓、臍帶血、臍帶、胎盤(pán)、脂肪、外周血及肌肉等各種組織中。Exosomes中義名稱為外來(lái)體或外泌體，是一種脂質(zhì)分子膜包裹的小囊泡，是胞外囊泡（exracellular vesicles）的一種，外泌體中包裹多種活性分子，如活性蛋白、RNAs（IncRNA、mcroRNA.、mRNA等）及DNA等。干細(xì)胞的外泌體可以對(duì)組織進(jìn)行損傷修復(fù)、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等，目前被研究于多種疾病模型中，如減少心肌梗死的面積，促進(jìn)腎臟的損傷修復(fù)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等。本論文主要就早產(chǎn)新生兒臍帶內(nèi)分離獲得的間充值干細(xì)胞外泌體的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行研究，研究這類(lèi)細(xì)胞外泌體進(jìn)行。

微電極的應(yīng)用

使用了unisense的微電極測(cè)試了MSC外泌體細(xì)胞的氧氣呼吸速率情況。在測(cè)試細(xì)胞的氧氣消耗前，所應(yīng)用的電極經(jīng)過(guò)矯正平衡，并獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中細(xì)胞的呼吸速率是以nmmol/min/mg單位表示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

間充值干細(xì)胞（MSCs）是干細(xì)胞家族的重要成員，具有高度增殖、自我更新能力、廣泛分布于骨髓、臍帶血、臍帶、胎盤(pán)、脂肪、外周血及肌肉等各種組織中。本論文研究分析早產(chǎn)兒與足月兒臍血分離的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的氧化磷酸化性能是應(yīng)用流式細(xì)胞儀、免疫印跡法、血樣定量法和熒光分析法進(jìn)行鑒定的。在使用Unisense微電極系統(tǒng)測(cè)試MSCs外泌體線粒體呼吸鏈復(fù)合物表達(dá)過(guò)程中的氧氣消耗情況時(shí)候發(fā)現(xiàn)，ATP合成酶能夠在足月新生兒的臍帶提取MSC外泌體中檢測(cè)到。MSC外泌體在不需要線粒體的情況下具有特定的有氧呼吸能力。

圖1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)足月兒和早產(chǎn)兒的UCB-MSCs表面標(biāo)記。其中的MSC細(xì)胞是足月新生兒胚胎提取的間質(zhì)干細(xì)胞（MSC）和早產(chǎn)新生兒胚胎提取的間質(zhì)干細(xì)胞。從圖中可以看出，不論是足月的還是早產(chǎn)兒臍帶提取的MSC細(xì)胞表面對(duì)CD73、CD105、CD90等表達(dá)特異性標(biāo)志物均表現(xiàn)為陽(yáng)性，而對(duì)于CD41、CD 34、CD14均呈現(xiàn)陰性，這說(shuō)明表達(dá)了典型間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD73、CD90和CD105，均不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34，CD45、CD14。

圖2、從UC MSC實(shí)驗(yàn)中分離出足月和早產(chǎn)兒臍帶提取的干細(xì)胞的外泌體的氧化磷酸化性質(zhì)研究。圖A、B指的是正常臍帶提取的干細(xì)胞外泌體以及早產(chǎn)兒臍帶提取的干細(xì)胞外泌體的氧消耗分析。這兩組細(xì)胞外泌體的呼吸作用會(huì)隨著NADH以及琥珀酸鹽的加入而增強(qiáng)，而魚(yú)藤酮和抗酶素的加入會(huì)抑制其細(xì)胞的呼吸。其中的氧氣消耗是以u(píng)mol為單位。圖C表示的是對(duì)比MSC線粒體（白色空心柱）、早產(chǎn)新生兒臍帶提取MSC外泌體（灰色柱）、正常新生兒臍帶提取MSC外泌體（淡灰色柱）、使用尼日利亞菌素處理過(guò)的早產(chǎn)新生兒臍帶提取MSC外泌體（斜線柱）、使用尼日利亞菌素處理過(guò)的正常新生兒臍帶提取MSC外泌體（黑色柱）的呼吸速率，其中的氧氣呼吸速率的單位是nmol O/min/mg。圖D指的是這些細(xì)胞線粒體在進(jìn)行正常呼吸代謝時(shí)的ATP生產(chǎn)對(duì)比。圖E指的是MSC線粒體、正常新生兒臍帶提取MSC外泌體線粒體以及早產(chǎn)新生兒臍帶提取MSC外泌體線粒體進(jìn)行呼吸代謝過(guò)程的電子轉(zhuǎn)移情況分析。上述實(shí)驗(yàn)，每組數(shù)據(jù)都是測(cè)試5次獲得的平均數(shù)據(jù)。

圖3、蛋白的氧化磷酸化表達(dá)評(píng)價(jià)，采用了免疫印跡法。圖A指的是使用免疫印跡法（WB）分析ATP的合成酶以及來(lái)自于早產(chǎn)兒和正常足月新生兒臍帶分離獲得的MSC外泌體細(xì)胞中線粒體呼吸鏈復(fù)合物的凝膠電泳圖像分析。圖B表示的是上述外泌體中線粒體呼吸鏈復(fù)合物（NADH-Q氧化還原媒（也稱為復(fù)合物I）、細(xì)胞色素C氧化酶（也稱為復(fù)合物IV）ATPase(ATP合成酶復(fù)合物V)）表達(dá)的密度分析。圖C指的是二維細(xì)胞培養(yǎng)法獲得的正常新生兒臍帶提取的外泌體的二維凝膠電泳圖像（經(jīng)過(guò)銀染色）。圖D指的是使用紅色染色后的外泌體膜外的表面蛋白表達(dá)的二維凝膠電泳圖像。圖E指的是免疫印跡法分析ATP合成酶的β-表面蛋白抗體分析的凝膠電泳圖像。

總結(jié)

人臍血是指臍帶內(nèi)及胎盤(pán)近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，研究顯示其除含有豐富的造血干細(xì)胞外，還含有其他的干/祖細(xì)胞，包括間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞等。本論文研究了間充值干細(xì)胞外泌體的相關(guān)性質(zhì)。通過(guò)對(duì)早產(chǎn)兒與足月兒臍帶血提取分離獲得相應(yīng)的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以通過(guò)改善氧化應(yīng)激反應(yīng)及抑制凋亡而保護(hù)腎臟免受四氯化碳誘導(dǎo)的損傷。干細(xì)胞來(lái)源的exosomes在組織重建上起到了很重要的作用，其在再生醫(yī)學(xué)方面得到了廣泛的實(shí)驗(yàn)研究。本論文應(yīng)用了流式細(xì)胞儀分析外泌體細(xì)胞進(jìn)行了UCB-MSC表面標(biāo)記，并且應(yīng)用Unisense微電極系統(tǒng)測(cè)試了外泌體在進(jìn)行氧化磷酸化過(guò)程中的線粒體呼吸鏈酶電子轉(zhuǎn)移過(guò)程中的氧氣消耗情況，從而得出了MSC外泌體在沒(méi)有線粒體的情況下也能進(jìn)行有氧代謝，這也進(jìn)一步說(shuō)明了，使用微電極系統(tǒng)可以很好的發(fā)揮MSC干細(xì)胞外泌體在治療組織損傷、皮膚修復(fù)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面存在著廣泛的應(yīng)用。