背景介紹:利用太陽能提供了一個(gè)方法來減少對化石燃料的依賴產(chǎn)生氫氣。作為人類和整個(gè)社會(huì)，我們始終依賴光合作用。一些藍(lán)細(xì)菌和綠藻分別具有NiFe-或FeFe-氫酶，這使它們能夠自然產(chǎn)生H2。氫氣要么在黑暗中的發(fā)酵條件下產(chǎn)生，要么在照明的開始時(shí)作為光合作用產(chǎn)生的氫。研究人員嘗試通過光合作用產(chǎn)生氫氣已經(jīng)有一段時(shí)間了，一些人通過在活細(xì)胞的體外融合不同的氫化酶（H2酶）與光合系統(tǒng)（PSI）取得了成功。氫化酶是催化質(zhì)子還原成氫氣的酶，而光系統(tǒng)是一個(gè)完整的膜蛋白復(fù)合物，通常在光合作用過程中捕捉太陽光的能量。過去的研究介紹了一些將氫化酶與光系統(tǒng)融合的技術(shù)，但迄今為止，所有這些技術(shù)都只在體外（即在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中和活細(xì)胞外）證明有效。在體外系統(tǒng)中，由于缺少了能夠自我修復(fù)、維護(hù)和復(fù)制的活細(xì)胞，因此，體外系統(tǒng)的壽命本來就很短。因此，最有效生產(chǎn)氫氣的技術(shù)應(yīng)該在體內(nèi)（即活細(xì)胞內(nèi)）才能很好地發(fā)揮作用。

本論文的研究人員最近設(shè)計(jì)出了一種光合作用產(chǎn)生氫氣的方法，這種方法需要在體內(nèi)融合藍(lán)藻菌內(nèi)的氫酶和光系統(tǒng)，研究人員率先提出了通過光合系統(tǒng)和氫酶在體內(nèi)融合高效生產(chǎn)太陽能氫的概念證明。該研究為大規(guī)?？沙掷m(xù)生產(chǎn)氫氣開辟了新的可能性。

Unisense微呼吸系統(tǒng)的應(yīng)用

用微呼吸系統(tǒng)（Unisense）測量了藍(lán)藻菌的發(fā)酵，短期和長期的氫轉(zhuǎn)化率。將細(xì)胞懸浮液置于unisense的微呼吸瓶中（雙室），并分別添加葡萄糖，葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶至終濃度分別為10 mM，16 U ml–1和20 U ml–1。在將氧氣和氫氣微呼吸電極插入每個(gè)腔室后開始測量。在藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)物的水相中連續(xù)監(jiān)測氧和氫的濃度。微呼吸瓶中（雙室）用玻璃蓋密封，因此理想情況下樣品上方不存在氣相。但是，放置傳感器的端口無法完全密封，因此H2從樣品中擴(kuò)散出的量很小。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

提出了一種通過與PSI融合的氫化酶光學(xué)生產(chǎn)H 2的體內(nèi)方法，作為進(jìn)一步的概念驗(yàn)證。所得突變體psaD-hoxYH產(chǎn)生500μM光學(xué)產(chǎn)H2，這是目前為止報(bào)道的藍(lán)細(xì)菌光學(xué)產(chǎn)氫的最高濃度。突變體的新陳代謝提供自我修復(fù)，維持和復(fù)制，從而產(chǎn)生持久耐用的光學(xué)產(chǎn)氫的生產(chǎn)系統(tǒng)。藍(lán)藻Synechocstis sp.PCC 6803的NiFe-氫化酶HoxYH與其光系統(tǒng)I亞基PsaD融合，靠近4Fe4S簇FB，通常為鐵氧還蛋白提供電子,所得的psaD-hoxYH突變體以光養(yǎng)方式生長，在厭氧條件下，在太陽光的厭氧條件下實(shí)現(xiàn)500μM高濃度光合產(chǎn)氫，且不吸收產(chǎn)生的氫。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，psaD-hoxYH中光合氫的產(chǎn)生最有可能是基于有氧和無氧光合作用。

圖1、WT和ΔHOX/hoxYH在750納米下（OD750相關(guān)的光密度培養(yǎng)物）培養(yǎng)后產(chǎn)氫效果。

圖2、在黑暗中不存在DCMU和存在DCMU的情況下在厭氧條件下和光照下，WT和psaD-hoxYH中體內(nèi)瞬時(shí)產(chǎn)生光和產(chǎn)H2和O2。通過添加葡萄糖，葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶來達(dá)到厭氧條件。a，隨著H2的吸收，WT菌株中發(fā)酵和短暫的光和產(chǎn)H 2濃度。b，在psadh-hoxyh中達(dá)到瞬時(shí)photoH2濃度。psadh-hoxyh沒有發(fā)酵產(chǎn)氫和H2吸收。c，d，WT（c）和psaD-hoxYH（d）中H 2的產(chǎn)生速率。?，WT中瞬時(shí)光和產(chǎn)H 2的平均濃度（n=17，–DCMU；n=12，+DCMU）和psaD-hoxYH（n=22，–DCMU；n=9，+DCMU）。f，在WT中暫時(shí)性光和產(chǎn)H 2的平均速率和PSAD-hoxYH（?=22，-DCMU;?=9+DCMU）下光和產(chǎn)H 2的平均速率。

圖3、在不存在和存在DCMU的情況下，在連續(xù)光照下厭氧條件下，WT和psaD-hoxYH中持久的體內(nèi)光和產(chǎn)H2。通過添加葡萄糖，葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶來達(dá)到厭氧條件。a，在WT和psaD-hoxYH中長期光和產(chǎn)H2。b，WT和psaD-hoxYH中持久的光和產(chǎn)H2的速率。c，將WT，ΔhoxH和psaD-hoxYH與700μM H 2在黑暗中于厭氧條件下孵育。在箭頭指示的時(shí)間打開燈以測量H 2攝取，H2攝取存在于WT中，但在兩個(gè)突變體中都完全不存在。d，由WT和psaD-hoxYH生產(chǎn)的持久光和產(chǎn)H2的最大濃度。e，由WT（n=8，–DCMU；n=5，+DCMU）和psaD-hoxYH（n=16，–DCMU；n=8，+DCMU）產(chǎn)生的持久光和產(chǎn)H 2的平均濃度。從不同的樣品中進(jìn)行測量；n代表樣本數(shù)。F，在WT生產(chǎn)（n=6，-DCMU;n=3，+DCMU）和PSAD-hoxYH（n=19，-DCMU;?=4，+DCMU）持久光和產(chǎn)H2的平均速率。

圖4、在連續(xù)光下，厭氧條件下WT和psaD-hoxYH中持久光和產(chǎn)H 2對光的依賴性。通過添加葡萄糖，葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶（EM）來維持無氧條件。圖的底部用黑色（熄滅）和白色（點(diǎn)亮）框表示照明條件。a，b，WT（a）和psaD-hoxYH（b）中光合產(chǎn)H2和氧的濃度。c，d，WT（c）和psaD-hoxYH（d）中光合產(chǎn)H2的的速率。

圖5、在DCMU存在下，WT和psaD-hoxYH中對葡萄糖依賴性及持久的光和產(chǎn)H 2。通過在開始測量之前用氬氣吹掃培養(yǎng)物10分鐘來達(dá)到厭氧條件。a，b，WT（a）和psaD-hoxYH（b）中的光合產(chǎn)H2濃度。c，d，WT（c）和psaD-hoxYH（d）中的光和產(chǎn)H 2的生產(chǎn)率。圖的底部用黑色（熄滅）和白色（點(diǎn)亮）框表示照明條件。

結(jié)論與展望

研究人員嘗試通過光合作用產(chǎn)生氫氣已經(jīng)有一段時(shí)間了，一些人通過在活細(xì)胞的體外融合不同的氫化酶（H2酶）與光合系統(tǒng)（PSI）取得了成功。氫化酶是催化質(zhì)子還原成氫氣的酶，而光系統(tǒng)是一個(gè)完整的膜蛋白復(fù)合物，通常在光合作用過程中捕捉太陽光的能量。過去的研究介紹了一些將氫化酶與光系統(tǒng)融合的技術(shù)，但迄今為止，所有這些技術(shù)都只在體外（即在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中和活細(xì)胞外）證明有效。在體外系統(tǒng)中，由于缺少了能夠自我修復(fù)、維護(hù)和復(fù)制的活細(xì)胞，體外系統(tǒng)的壽命本來就很短。因此最有效生產(chǎn)氫氣的技術(shù)應(yīng)該在體內(nèi)（即活細(xì)胞內(nèi)）才能很好地發(fā)揮作用。本論文研究人員設(shè)計(jì)出了一種光合作用產(chǎn)生氫氣的方法，這種方法需要在體內(nèi)融合氫酶和光系統(tǒng)。所得的psaD-hoxYH突變體以光養(yǎng)方式生長，在厭氧條件下，在光下可達(dá)到500μM的光合作用產(chǎn)生的氫的高濃度，并且不會(huì)吸收產(chǎn)生的氫。藍(lán)藻菌體內(nèi)光合產(chǎn)氫過程中所產(chǎn)生的氫氣是使用了unisense微呼吸系統(tǒng)監(jiān)測完成的。相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，psaD-hoxYH中光合產(chǎn)氫最有可能是基于有氧和無氧光合作用。該研究率先提出了通過光合系統(tǒng)和氫酶在體內(nèi)融合高效生產(chǎn)太陽能氫的概念證明，該研究可能為大規(guī)?？沙掷m(xù)生產(chǎn)氫氣開辟了新的可能性。