看法

探針耗氧量的方法學(xué)方法。 為了確保微探針的耗氧量與細(xì)菌的耗氧量相比可以忽略不計(jì)，我們?cè)?4小時(shí)內(nèi)平行培養(yǎng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)了相同水的0.6-μm和0.2-μm過(guò)濾子樣本中的氧濃度（圖2）。 0.2-μm過(guò)濾水中的氧濃度在培養(yǎng)0至15 h期間保持恒定（215μm O2，圖2）。 培養(yǎng)15小時(shí)后觀察到的減少是由于通過(guò)過(guò)濾器的殘留小細(xì)菌的生長(zhǎng)和/或由于儀器無(wú)法進(jìn)行高壓滅菌而污染樣品造成的。 對(duì)于在含有大多數(shù)細(xì)菌的0.6μm（圖2）上過(guò)濾的樣品（平均值為90%±4%，n=31，Torréton等人未經(jīng)過(guò)濾的數(shù)據(jù)未經(jīng)過(guò)濾），這種殘留污染可以忽略不計(jì)。 微探針不消耗氧氣是一個(gè)相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵诟∮嗡蛑惺褂玫拇蠖鄶?shù)氧氣測(cè)量設(shè)備都涉及氧氣宏觀探針（Griffith 1988；Langdon 1993），其顯示內(nèi)部氧氣消耗，導(dǎo)致氧氣消耗的高估，除非糾正。

圖2. 站N12（2003年5月6日）0.6-和0.2-μm過(guò)濾子樣本暗培養(yǎng)期間的氧氣濃度。

再現(xiàn)性。 使用Winkler方法的耗氧量估計(jì)通常是重復(fù)進(jìn)行的。 在我們的研究中，測(cè)量氧氣濃度的設(shè)備的可用性使我們無(wú)法在重復(fù)中系統(tǒng)地估計(jì)氧氣消耗量。 然而，在一些情況下，我們檢查了重復(fù)水樣的再現(xiàn)性。 圖3顯示了同一站點(diǎn)的兩個(gè)樣本中氧氣濃度的時(shí)間過(guò)程非常相似。

圖3. 在N12站（2003年4月10日）0.6-μm過(guò)濾子樣本的黑暗培養(yǎng)期間的氧氣濃度。

氧微探針的精密度。 表2顯示了用于測(cè)量浮游生物系統(tǒng)中氧濃度的不同技術(shù)。 Winkler技術(shù)是最常用的技術(shù)，已經(jīng)開(kāi)展了許多工作來(lái)提高這種化學(xué)測(cè)定氧濃度的精度。 氧微探針的精度（0.05%）相當(dāng)于Roland等人（1999）和Sherr及Sherr（2003）所述的高精度Winkler技術(shù)。

<0.6-μm過(guò)濾樣品中的呼吸趨勢(shì)-離散O2或CO2測(cè)量用于估計(jì)呼吸的一個(gè)主要缺點(diǎn)是，它們需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間才能觀察到與初始氧氣濃度的顯著差異。 然后假設(shè)耗氧量是線性的，這通常不容易用溫克勒滴定法在短時(shí)間內(nèi)驗(yàn)證。 在之前的一項(xiàng)研究中，Pomeroy等人（1994年）觀察到在每5小時(shí)進(jìn)行一次離散氧測(cè)量的24小時(shí)孵化期間氧濃度時(shí)間過(guò)程的不同趨勢(shì)。 他們?nèi)种坏臄?shù)據(jù)沒(méi)有顯示氧濃度隨時(shí)間的線性下降。 因此，他們建議持續(xù)監(jiān)測(cè)氧氣濃度，以便更好地估計(jì)細(xì)菌呼吸。 然后假設(shè)耗氧量是線性的，這通常不容易用溫克勒滴定法在短時(shí)間內(nèi)驗(yàn)證。在之前的一項(xiàng)研究中，Pomeroy等人（1994年）觀察到在每5小時(shí)進(jìn)行一次離散氧測(cè)量的24小時(shí)孵化期間氧濃度時(shí)間過(guò)程的不同趨勢(shì)。他們?nèi)种坏臄?shù)據(jù)沒(méi)有顯示氧濃度隨時(shí)間的線性下降。因此，他們建議持續(xù)監(jiān)測(cè)氧氣濃度，以便更好地估計(jì)細(xì)菌呼吸。

氧氣微探針的使用使我們能夠連續(xù)跟蹤呼吸瓶中的氧氣濃度。 然后將氧濃度數(shù)據(jù)與時(shí)間擬合成指數(shù)衰減方程，然后根據(jù)擬合函數(shù)的一階導(dǎo)數(shù)計(jì)算呼吸的時(shí)間過(guò)程。 同時(shí)，在重復(fù)0.6-μm過(guò)濾樣品的24小時(shí)黑暗培養(yǎng)期間，每5小時(shí)測(cè)定一次3H-胸腺嘧啶核苷摻入和細(xì)菌豐度。 圖4顯示了兩種對(duì)比營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下（M10，貧營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，D01，富營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，見(jiàn)圖1）的呼吸、細(xì)菌豐度和細(xì)菌產(chǎn)生的時(shí)間過(guò)程。

圖4. 來(lái)自富營(yíng)養(yǎng)化D01（a）和貧營(yíng)養(yǎng)化場(chǎng)地M10（B）的0.6μm濾液的細(xì)菌豐度（?）、TdR摻入（）和呼吸（-）。 條形代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。

在富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)場(chǎng)樣品中，顯著的呼吸僅在2至3小時(shí)后出現(xiàn)（圖4A），而在貧營(yíng)養(yǎng)現(xiàn)場(chǎng)樣品中，僅在8至10小時(shí)后出現(xiàn)（圖4B）。

在D01（圖4A）中，TdR摻入率顯著增加，在孵育24小時(shí)內(nèi)從6 pM h增加到180 pM h–1。 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，細(xì)菌豐度達(dá)到初始值的5倍。 呼吸在培養(yǎng)2小時(shí)后達(dá)到最大值（2.5μM O2 h–1），然后下降，直到培養(yǎng)15小時(shí)后變得幾乎為零。 TdR和細(xì)菌豐度的增加表明細(xì)菌可能不受資源限制。 觀察到的生產(chǎn)和消費(fèi)之間的差異表明，正如del Giorgio和Cole（1998）所建議的，這兩個(gè)過(guò)程之間存在時(shí)間上的不耦合。 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，細(xì)菌豐度達(dá)到初始值的5倍。呼吸在培養(yǎng)2小時(shí)后達(dá)到最大值（2.5μM O2 h–1），然后下降，直到培養(yǎng)15小時(shí)后變得幾乎為零。TdR和細(xì)菌豐度的增加表明細(xì)菌可能不受資源限制。觀察到的生產(chǎn)和消費(fèi)之間的差異表明，正如del Giorgio和Cole（1998）所建議的，這兩個(gè)過(guò)程之間存在時(shí)間上的不耦合。

來(lái)自寡營(yíng)養(yǎng)部位的樣本（圖4B）在數(shù)小時(shí)的滯后期后顯示胸腺嘧啶核苷摻入增加。類(lèi)似地，顯著呼吸僅在6小時(shí)的滯后期后才可測(cè)量，并且速率（0.6μM O2 h–1）在接下來(lái)的15小時(shí)內(nèi)幾乎保持不變，而胸腺嘧啶核苷摻入率持續(xù)增加，直到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)達(dá)到45 pM TdR h–1。在最初的15小時(shí)內(nèi)，細(xì)菌數(shù)量增加了2.5倍，并在1.4×106細(xì)胞mL–1附近達(dá)到一個(gè)平臺(tái)。

這些結(jié)果允許優(yōu)化培養(yǎng)時(shí)間，以測(cè)量貧營(yíng)養(yǎng)和富營(yíng)養(yǎng)場(chǎng)所異養(yǎng)細(xì)菌的耗氧量。此外，3H-胸腺嘧啶核苷摻入和細(xì)菌豐度的平行趨勢(shì)證明了該方法的局限性。事實(shí)上，應(yīng)謹(jǐn)慎解釋結(jié)果，考慮到測(cè)量結(jié)果更能代表瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生的過(guò)程，而不是初始原位條件。

M10站的結(jié)果表明，只有當(dāng)細(xì)菌數(shù)量和活性增加時(shí)，才能觀察到顯著的耗氧量。這種活性的增加可能是由于>0.6μm生物體的捕食釋放、過(guò)濾過(guò)程中脆弱細(xì)胞的破壞、玻璃材料上有機(jī)物的瓶效應(yīng)吸附和濃縮，或培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌群落的變化（Sch?fer等人，2000年；Massana等人，2001年；Fuchs等人，2000年；Gattuso等人，2002年）。Biddanda等人（1994年）已經(jīng)表明，在墨西哥灣北部不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的水域中培養(yǎng)期間，細(xì)菌的豐度和活性都會(huì)增加。在他們的研究中，在培養(yǎng)20小時(shí)后，高產(chǎn)陸架水域和低產(chǎn)坡水域的細(xì)菌產(chǎn)量分別增加了12倍和8倍。Likew在ise中，富營(yíng)養(yǎng)化場(chǎng)所的細(xì)菌豐度增加了1.5倍，而貧營(yíng)養(yǎng)場(chǎng)所的細(xì)菌豐度保持不變。因此，在這些孵化過(guò)程中，群落的進(jìn)化和活性測(cè)量并不能真正代表初始條件。

因此，最好在最短的時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)，以保持最接近初始條件。因此，我們選擇以5小時(shí)間隔計(jì)算的斜率來(lái)測(cè)量細(xì)菌呼吸。這一時(shí)間是確保氧氣濃度顯著降低的最短時(shí)間和最小值之間的最佳折衷時(shí)間增加細(xì)菌DNA合成率（1.19±0.21倍）和豐度（1.42±0.09倍）。當(dāng)我們觀察到氧氣顯著減少時(shí)，選擇間隔的開(kāi)始。

連續(xù)O2測(cè)量與離散O2測(cè)量我們從16個(gè)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)對(duì)比的站點(diǎn)共收集了27個(gè)樣本（表1）圖5顯示了我們研究期間觀察到的氧濃度的不同時(shí)間過(guò)程。圖6顯示了估算細(xì)菌呼吸的離散方法和連續(xù)方法之間的比較。

圖5.氧氣濃度和預(yù)測(cè)呼吸隨時(shí)間變化的不同趨勢(shì)表示。n表示我們研究期間觀察到的相應(yīng)病例數(shù)。兩條線表示間隔（5小時(shí)）用于計(jì)算細(xì)菌呼吸。對(duì)于b型和c型，起始點(diǎn)從最小減少0.5μM O2開(kāi)始設(shè)置（見(jiàn)正文）。

表1.在整個(gè)水柱上取樣的站的平均特征

27例中只有9例在孵化期間表現(xiàn)出恒定的O2消耗（模型a，圖5和圖6）因此，在計(jì)算細(xì)菌呼吸時(shí)沒(méi)有顯示出重要的偏差。在模型a中，估計(jì)細(xì)菌呼吸的離散方法將給出與通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)氧氣濃度所估計(jì)的結(jié)果相似的結(jié)果。該模型表征了顯示低凈細(xì)菌產(chǎn)量的水樣的呼吸（圖7）。

圖6.通過(guò)離散和連續(xù)O2測(cè)量估計(jì)的呼吸比較。對(duì)于離散方法，呼吸是根據(jù)孵化開(kāi)始和結(jié)束時(shí)（14小時(shí)或24小時(shí)）的氧氣濃度之間的差異計(jì)算的。

圖7.培養(yǎng)過(guò)程中觀察到的平均凈細(xì)菌生物量的分布，作為耗氧量模型的函數(shù)。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

模型b在氧氣減少之前呈現(xiàn)5到10小時(shí)的滯后階段。一般來(lái)說(shuō)，該模型是開(kāi)放瀉湖樣帶（圖1）中寡營(yíng)養(yǎng)樣品（7個(gè)樣品中的4個(gè)）的特征。在模型b中，通過(guò)離散方法估計(jì)的呼吸將導(dǎo)致氧消耗率的低估（圖6）。正如模型a所觀察到的，模型b是水樣的特征，表現(xiàn)出較低的凈細(xì)菌產(chǎn)量（圖7）。在模型c中，由于生物量和產(chǎn)量的增加，消耗量隨著時(shí)間的推移而增加。因此，與5小時(shí)時(shí)間間隔內(nèi)的連續(xù)氧氣記錄相比，離散方法會(huì)高估BR（圖6）。根據(jù)模型c呼吸的樣本的特征是細(xì)菌凈產(chǎn)量最高（圖7）。最后，在模型d中，斜率在孵化開(kāi)始時(shí)最大，隨后減小。這種趨勢(shì)是富營(yíng)養(yǎng)化場(chǎng)所的特征，可能是由于營(yíng)養(yǎng)資源的枯竭和隨后異養(yǎng)細(xì)菌活性的降低。對(duì)于模型d，用于估計(jì)細(xì)菌呼吸的離散方法將導(dǎo)致比使用連續(xù)監(jiān)測(cè)確定的值更低的速率（圖6）。

這些不同的模型顯示了氧動(dòng)力學(xué)的巨大可變性，因此難以選擇如何計(jì)算細(xì)菌耗氧量。同樣，在之前的一項(xiàng)研究中，Pomeroy等人（1994年）從24小時(shí)培養(yǎng)期間進(jìn)行的離散氧測(cè)量中觀察到4種不同的氧趨勢(shì)。即使在我們的研究中，模型a/b和c/d可以分配給不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的水，如細(xì)菌生物量?jī)舢a(chǎn)量所示（圖7），我們也不能將一個(gè)模型分配給任何特征點(diǎn)。這一結(jié)果強(qiáng)調(diào)了需要持續(xù)監(jiān)測(cè)浮游微生物的耗氧量，以便以最小偏差評(píng)估呼吸速率。

圖8. 用細(xì)菌凈生物量（bgebpnet）估算的BGE與用3H-胸腺嘧啶核苷摻入（BGEBP）測(cè)定的細(xì)菌產(chǎn)量估算的BGE之間的關(guān)系。

BGE-BGE的估計(jì)通常通過(guò)細(xì)菌呼吸計(jì)算的細(xì)菌產(chǎn)量（用3H亮氨酸或3H胸腺嘧啶核苷摻入測(cè)量）的替代物來(lái)確定。在我們的研究中，我們根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程中觀察到的用于細(xì)菌呼吸測(cè)定的豐度變化來(lái)估算凈細(xì)菌生物量（見(jiàn)材料和程序）。這樣，控制BGE的兩個(gè)進(jìn)程在相同的條件下確定。圖8顯示了用凈細(xì)菌生物量產(chǎn)量（BGEBNET）估算的BGE與用3H-胸腺嘧啶核苷摻入（BGEBP）測(cè)定的細(xì)菌產(chǎn)量估算的BGE之間的關(guān)系。除了一個(gè)站點(diǎn)外，bgebpnet始終高于BGEBP?？墒褂镁€性回歸（R2=0.75，n=24，P<0.001）將BGEBnet和BGEBP與以下等式關(guān)聯(lián)：

這一趨勢(shì)表明，當(dāng)根據(jù)示蹤物摻入估算的細(xì)菌產(chǎn)量估算BGE時(shí)，將導(dǎo)致低估細(xì)菌生長(zhǎng)效率。這一低估可能是由于確定兩個(gè)過(guò)程的培養(yǎng)時(shí)間存在差異（TdR衍生細(xì)菌生產(chǎn)為1小時(shí)，細(xì)菌凈生物量生產(chǎn)為12至24小時(shí)）。

用于估計(jì)BGE的24小時(shí)培養(yǎng)可導(dǎo)致生物量和細(xì)菌產(chǎn)量的強(qiáng)烈變化，如圖4所示。細(xì)菌生物量和產(chǎn)量的這些變化會(huì)強(qiáng)烈影響B(tài)GE的測(cè)定。圖9顯示了根據(jù)圖4所示數(shù)據(jù)計(jì)算的24小時(shí)孵育期間BGE的時(shí)間過(guò)程。在富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)場(chǎng)（D01），BGE在孵化開(kāi)始時(shí)等于7%，并且隨著時(shí)間的推移而強(qiáng)烈增加，在孵化20小時(shí)后達(dá)到53%的最大值。BGE的增加是由于孵化期間呼吸速率的強(qiáng)烈下降，伴隨著恒定的凈生物量細(xì)菌產(chǎn)量（圖4A）。Coffin等人（1993年）觀察到24小時(shí)培養(yǎng)期間細(xì)菌豐度和呼吸的類(lèi)似模式，導(dǎo)致BGE有規(guī)律地增加。類(lèi)似地，Pomeroy等人（1994年）觀察到氧呼吸減少（使用多點(diǎn)Winkler滴定法）伴隨著由亮氨酸摻入確定的細(xì)菌產(chǎn)量的規(guī)律性增加。這些觀察到的兩個(gè)過(guò)程的時(shí)間過(guò)程導(dǎo)致在孵化期間BGE有規(guī)律地增加。高初始呼吸速率伴隨著低細(xì)菌產(chǎn)量（導(dǎo)致低BGE值）可能表明這兩個(gè)過(guò)程并不像del Giorgio和Cole（1998）之前所建議的那樣耦合。

圖9. 在兩種對(duì)比營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下，BGE在24小時(shí)孵化期間的時(shí)間過(guò)程。 用于計(jì)算BGE的數(shù)據(jù)來(lái)自圖4。 對(duì)于M10站，在10小時(shí)間隔內(nèi)計(jì)算凈生物量產(chǎn)量，以獲得細(xì)菌豐度的顯著變化。 在兩種對(duì)比營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下，BGE在24小時(shí)孵化期間的時(shí)間過(guò)程。用于計(jì)算BGE的數(shù)據(jù)來(lái)自圖4。對(duì)于M10站，在10小時(shí)間隔內(nèi)計(jì)算凈生物量產(chǎn)量，以獲得細(xì)菌豐度的顯著變化。

相反，在寡營(yíng)養(yǎng)站點(diǎn)M10，呼吸作用和細(xì)菌凈生物量的產(chǎn)生隨時(shí)間保持不變（圖4B）。 因此，BGE在孵化期間沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的變化（圖9）。 24小時(shí)培養(yǎng)期間BGE的可能變化，如在富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)場(chǎng)觀察到的變化，強(qiáng)調(diào)有必要盡可能縮短培養(yǎng)時(shí)間，以盡量減少BGE測(cè)定中的偏差。 因此，BGE在孵化期間沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的變化（圖9）。24小時(shí)培養(yǎng)期間BGE的可能變化，如在富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)場(chǎng)觀察到的變化，強(qiáng)調(diào)有必要盡可能縮短培養(yǎng)時(shí)間，以盡量減少BGE測(cè)定中的偏差。

使用氧微電極來(lái)研究細(xì)菌的呼吸作用以確定浮游細(xì)菌的生長(zhǎng)速率——摘要

使用氧微電極來(lái)研究細(xì)菌的呼吸作用以確定浮游細(xì)菌的生長(zhǎng)速率——材料和程序

使用氧微電極來(lái)研究細(xì)菌的呼吸作用以確定浮游細(xì)菌的生長(zhǎng)速率——看法

使用氧微電極來(lái)研究細(xì)菌的呼吸作用以確定浮游細(xì)菌的生長(zhǎng)速率——討論、意見(jiàn)和建議！