【摘要】：細(xì)胞電融合技術(shù)自從由Zimmermann發(fā)明以來，就因為效率高、可控性強、操作簡便、重復(fù)性好、對細(xì)胞無毒害等優(yōu)點而得到廣泛應(yīng)用，逐漸成為現(xiàn)代生物工程技術(shù)中的一個重要工具，被廣泛應(yīng)用于物種產(chǎn)生或改良、單克隆抗體制備、癌癥免疫治療等領(lǐng)域。本文運用現(xiàn)代微機電系統(tǒng)(micro electro mechanical systems，MEMS)加工技術(shù)在厘米見方的基底材料上制作了微電極陣列細(xì)胞電融合芯片。所包含的微電極對數(shù)達(dá)到103數(shù)量級，微電極間距小于100μm。同時，研究開發(fā)了細(xì)胞電融合儀，可以與芯片集成為高通量細(xì)胞電融合系統(tǒng)，并利用介電電泳和細(xì)胞電致穿孔原理實現(xiàn)細(xì)胞操控和電融合。細(xì)胞定位、穿孔及擠壓操作是細(xì)胞電融合的基礎(chǔ)。因此，本文首先對細(xì)胞操控和電融合原理進(jìn)行了深入的探討，在此基礎(chǔ)上運用有限元方法分析了不同形狀、分布的微電極陣列在外加電壓條件下的電場分布，并以此為據(jù)來優(yōu)化微電極和微電極陣列設(shè)計，以獲得有利于細(xì)胞電融合的電場環(huán)境。在此期間確定了矩形梳狀交叉微電極陣列芯片模型。

隨后，對芯片加工工藝、材料、封裝技術(shù)等進(jìn)行了研究，成功研制了硅基底-硅微電極、玻璃基底-硅微電極、硅基底-全金屬微電極、電路板(printed circuit board，PCB)微電極等四種不同材料的細(xì)胞電融合芯片。同時，研制開發(fā)了細(xì)胞電融合儀。最后，在芯片和融合儀組成的高通量細(xì)胞電融合平臺上進(jìn)行了微生物、動物、植物細(xì)胞電融合實驗。

具體來說，論文研究工作主要包括以下幾個方面:

1.芯片上微電極尺寸及分布對電場強度及梯度的影響。在細(xì)胞融合芯片上，三維微電極的幾何及分布參數(shù)包括微電極厚度、寬度、深度、縱向間隔、橫向間隔，微電極尖端幾何形狀(直角形齒、錐形齒、平行板)，電極排列方式(對稱性和非對稱型)等。這些參數(shù)的改變都會對微通道中的電場強度及梯度產(chǎn)生影響。通過有限元方法，對微電極陣列進(jìn)行了建模仿真。根據(jù)細(xì)胞電融合的要求，提出了一種有利于細(xì)胞電融合的矩形梳狀交叉微電極陣列芯片模型，為實現(xiàn)高效細(xì)胞電融合奠定了理論基礎(chǔ)。在該芯片中，可以產(chǎn)生有利于細(xì)胞電融合的電場環(huán)境，提高對細(xì)胞的操控能力和融合率。

2.芯片和微電極材料及制作工藝的選擇。為了使細(xì)胞電融合芯片獲得最佳的電氣和生化性能，本文研究了全硅微電極、硅玻結(jié)合(玻璃基底加硅微電極)、硅基底全金屬微電極、PCB銅電極等四種芯片，包括其微電極和微通道設(shè)計、加工工藝選擇、封裝設(shè)計和材料選擇等。

3.細(xì)胞電融合儀的設(shè)計及制作。在研究了細(xì)胞電融合過程中涉及到的細(xì)胞操作，即排隊、電穿孔、擠壓等三個基本過程及所需電信號特征后，提出了用單頻正弦信號和雙向歸零高壓脈沖信號作為細(xì)胞電融合的最佳操控與穿孔信號。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計了信號產(chǎn)生電路、智能控制電路、顯示電路、高壓電源電路并進(jìn)行相應(yīng)的軟件編寫、PCB設(shè)計、電子裝配與調(diào)試，參數(shù)測試等，獲得了可以提供高通量細(xì)胞電融合所需電信號的細(xì)胞電融合儀，其技術(shù)指標(biāo)達(dá)到國內(nèi)先進(jìn)水平。

4.細(xì)胞電融合實驗研究。利用新研制的芯片和融合儀建立了細(xì)胞電融合實驗平臺，開展了微生物(酵母細(xì)胞)、動物(HEK-293、雞血細(xì)胞)、植物(煙草葉肉原生質(zhì)體)細(xì)胞的排隊或融合實驗。結(jié)果表明，芯片內(nèi)數(shù)量巨大微電極(103對/cm2數(shù)量級)可以同時操控大量細(xì)胞來完成排隊和電穿孔，從而實現(xiàn)高通量電融合。另一方面，由于微電極間距小到微米數(shù)量級，細(xì)胞操作和融合所需電壓很低，如細(xì)胞排隊電壓(Vpp)在6 V左右即可達(dá)到滿意效果，電穿孔脈沖電壓幅值也小于60 V。這樣，融合電壓的降低提高了細(xì)胞電融合系統(tǒng)安全性，也降低了電融合儀的設(shè)計要求和生產(chǎn)成本。通過一系列分析、仿真及實驗研究，使芯片內(nèi)微電極的設(shè)計、選材及加工工藝得以優(yōu)化，可以產(chǎn)生更有利于細(xì)胞電融合的電場和電場梯度分布。實驗結(jié)果表明，芯片上的細(xì)胞電融合可以獲得較高的電融合率。以煙草葉肉原生質(zhì)體的電融合為例，其融合率最高達(dá)到50.2%。動物細(xì)胞HEK-293的融合率最高也達(dá)39.1%，酵母細(xì)胞最高達(dá)33.4%，這些都較傳統(tǒng)的利用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)的化學(xué)融合方法的融合率(1%)和傳統(tǒng)電融合儀器上的融合率(10%)高出很多?？傊?，通過對細(xì)胞電融合芯片電極設(shè)計以及電學(xué)特性的研究，研制出高通量、高融合率的細(xì)胞電融合芯片，并根據(jù)細(xì)胞電融合過程和所需電信號要求，研制開發(fā)出智能化細(xì)胞電融合儀。集成融合芯片及電融合儀建立了細(xì)胞電融合微系統(tǒng)實驗平臺，在對微生物、動物、植物原生質(zhì)體等細(xì)胞的電融合實驗中，取得了很好的實驗效果。該研究為實現(xiàn)細(xì)胞電融合系統(tǒng)微型化、建立高效、自動的細(xì)胞融合芯片實驗室奠定了良好的基礎(chǔ)。