微電極具有幾何尺寸小、傳質速率快、i R降低、響應快速等優(yōu)點，已被廣泛應用于生命科學、環(huán)境檢測、臨床診斷等多個領域。離子選擇性電極作為一種經典的電化學傳感器，已經發(fā)展成為離子分析和電位傳感的理想工具。離子選擇性微電極可以為單細胞及沉積物孔隙水等微環(huán)境中各種離子的分析提供一種有效的檢測手段。自然水體中存在的單細胞生物是環(huán)境刺激所引起的生態(tài)效應最為直接的生物機體，可作為研究環(huán)境刺激所引發(fā)的毒理效應的理想模型。細胞內外離子濃度的變化是細胞受到環(huán)境刺激產生的毒理效應的前期階段。與已有的用于單細胞離子檢測的膜片鉗及熒光指示劑技術相比，電位型微電極傳感器具有成本低、操作簡單、響應快速、線性范圍寬、高的時間和空間分辨率等優(yōu)點。開發(fā)電位型微電極用以監(jiān)測單細胞膜表面離子濃度變化，對于研究環(huán)境刺激下細胞應激變化具有重要的科學價值和應用前景。沉積物孔隙水微環(huán)境中的重金屬離子與其生物可利用性以及生物地球化學過程等環(huán)境行為密切相關。因此，實現沉積物孔隙水中重金屬離子的準確、快速、靈敏檢測具有重要意義。

目前，沉積物孔隙水中重金屬離子的檢測一般采用現場提取與后續(xù)實驗室化學分析和儀器檢測相結合的方式。近年來，薄膜擴散平衡(DET)和薄膜擴散梯度(DGT)等技術被用于測定沉積物孔隙水中的重金屬離子。然而，這些技術操作復雜且耗時長。發(fā)展新型電位型微電極，可為孔隙水中重金屬的現場、快速、原位檢測提供一種新的途徑。與傳統(tǒng)內充液式離子選擇性電極相比，全固態(tài)離子選擇性電極具有易于小型化、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點。然而，高靈敏全固態(tài)電位型微電極的構建及其在單細胞毒理分析及孔隙水檢測中的應用鮮有關注。本論文制備了檢出限低、抗干擾能力強且電位響應穩(wěn)定的高靈敏全固態(tài)離子選擇性微電極，并探索了其在單細胞分析及沉積物孔隙水檢測中的應用。

本文實現了單細胞生物-草履蟲細胞膜表面鈣離子濃度變化的檢測以及沉積物孔隙水中銅、鉛等離子的檢測。本文發(fā)展的電位型微電極為單細胞毒理分析和沉積物重金屬的現場、原位檢測提供了技術支撐。

研究工作概括如下:

1.鈣離子選擇性微電極的制備及表征鈣離子不僅是細胞內常量元素，也是細胞內重要的第二信使，其含量變化對于細胞生理活動至關重要。與光學檢測方法相比，鈣離子選擇性微電極具有線性范圍寬、抗干擾能力強等優(yōu)點，是檢測單細胞鈣離子濃度變化的理想工具。已有的電位型微電極多為內充液式微電極，而全固態(tài)鈣離子選擇性微電極尚未見報道。本研究采用火焰熔融法，制備了碳纖維微電極(直徑為1-2μm)；采用電沉積法，制備了導電聚合物3，4-乙烯二氧噻吩-聚4-苯乙烯磺酸鈉(PEDOT-PSS)離子-電子傳導層；采用蘸涂法，制備了鈣離子選擇性微電極敏感膜。考察了電極的響應線性、選擇性及重現性。結果表明:PEDOT-PSS傳導層可提高鈣離子選擇性微電極電位穩(wěn)定性；鈣離子選擇性微電極在鈣離子活度范圍為1.0×10~(-7)-5.4×10~(-3)M(S=31.4 m V/dec，R~2=0.992)內呈能斯特響應，檢出限為6.3×10~(-8)M；此外，該電極對多種干擾離子具有良好的選擇性，且重現性良好。

2.微參比電極的制備及表征微參比電極作為微檢測系統(tǒng)的必要組成部分，其制備及性能至關重要。與傳統(tǒng)材料燒結玻璃相比，瓊脂糖凝膠具有熱可逆性，在融化狀態(tài)下可通過虹吸效應吸入毛細玻璃管，且可通過氫鍵連接形成網狀結構。本研究以瓊脂糖凝膠為鹽橋，采用Ag/Ag Cl絲，制備了微參比電極(直徑為8-10μm)，并考察了微參比電極的性能。結果表明:微參比電極在不同溶液濃度(10~(-5)M-10~(-1)M)和價態(tài)(一價或二價離子)的電解質溶液、不同p H(3-10)及不同比例(0.1-10)氧化還原物質Fe(CN)_6~(3-)/Fe(CN)_6~(4-)的溶液中均具有良好的電位穩(wěn)定性。與現有的微參比電極相比，該微參比電極具有穩(wěn)定性高、操作簡單、易于小型化等優(yōu)點。

3.鈣離子選擇性微電極檢測毒死蜱作用下草履蟲細胞膜表面鈣離子吸收毒死蜱是一種被廣泛使用的有機磷殺蟲劑，它能夠對天然水體中的生物系統(tǒng)造成危害。我們以草履蟲為環(huán)境毒理評價模型，研究毒死蜱作用下草履蟲細胞膜表面鈣離子濃度的變化。本研究在上述制備的鈣離子選擇性微電極及微參比電極的基礎上，結合倒置顯微鏡、微操作器等儀器，構建了電位型微電極單細胞毒理分析平臺。通過鈣離子選擇性微電極原位檢測草履蟲細胞膜表面鈣離子濃度的變化，研究毒死蜱對草履蟲單細胞毒理效應。結果表明:草履蟲在毒死蜱作用下，細胞膜表面鈣離子通過鈣離子通道開放被吸收，進而導致電位下降，草履蟲對毒死蜱的敏感濃度為1-5μM。

4.銅離子選擇性微電極的構建及在沉積物孔隙水分析中的應用對于沉積物孔隙水的檢測，需要微電極具有一定的機械強度。因此，本研究采用金絲作為電極材料，采用火焰熔融法，制備了金微電極(直徑為14μm)；通過電沉積PEDOT-PSS，修飾了傳導層；將銅離子選擇性聚合物膜蘸涂至修飾電極表面，制備得到全固態(tài)銅離子選擇性微電極。對銅離子選擇性微電極電化學性能以及電位響應特性進行了表征。在優(yōu)化條件下，銅離子選擇性微電極在0.5 M Na Cl背景溶液下對Cu~(2+)的能斯特響應活度范圍為2.5×10~(-7)-2.5×10~(-4)M，檢出限為4.0×10~(-8)M。該銅離子選擇性微電極成功用于經預處理的沉積物孔隙水中Cu~(2+)的檢測，且檢測結果與陽極溶出伏安法一致。該微電極具有檢測靈敏度高、所需樣品體積較小(300微升)等優(yōu)點。該全固態(tài)銅離子選擇性微電極有望用于海岸帶沉積物孔隙水中Cu~(2+)的原位檢測。此外，該微電極制備方法可通過改變不同種類離子選擇性膜，實現對沉積物孔隙水中其它重金屬離子的檢測。

5.鉛離子選擇性微電極的構建及在海岸帶沉積物孔隙水原位檢測中的應用我們制備了鉛離子選擇性微電極，以期實現孔隙水中鉛離子的原位分析。本研究對鉛離子選擇性聚合物膜各組分組成比進行了優(yōu)化，并對其電化學性能以及電位響應特性進行了表征。結果表明:所制備的全固態(tài)鉛離子選擇性微電極，在0.5 M Na Cl背景下，對Pb~(2+)的能斯特響應活度范圍為2.1×10~(-9)-2.1×10~(-4)M Pb(NO_3)_2(S=28.1 m V/dec，R~2=0.999)，檢出限為6.4×10~(-10)M。將鉛離子選擇性金微電極和微參比電極組成微電極檢測體系，結合微操作器平臺，在實驗室條件下，實現了對所采集沉積物孔隙水中鉛離子的垂直剖面原位檢測。

6.基于全固態(tài)銅離子選擇性微電極的計時電位分析法的構建游離態(tài)形式存在的重金屬在海水重金屬總量所占比例非常小，因此對電位檢測電極的靈敏度和檢出限均提出了較高的要求。實驗表明，上述電位型微電極在部分孔隙水樣品中難以實現重金屬離子的檢測。計時電位法的檢出限和靈敏度均優(yōu)于電位法，且可實現電極的可逆性使用。本論文在全固態(tài)離子選擇性微電極研制的基礎上，采用計時電位法，對重金屬離子檢測進行了研究。以銅離子檢測為例，制備了全固態(tài)銅離子選擇性微電極，并對施加電流大小、膜厚度等進行了優(yōu)化。在最優(yōu)條件下，銅離子選擇性微電極對Cu~(2+)的活度線性范圍為2.5×10~(-10)-2.5×10~(-7)M(S=60.1 m V/dec，R~2=0.996)，檢出限為1.4×10~(-10)M。基于全固態(tài)離子選擇性微電極的計時電位法有望用于海岸帶沉積物孔隙水中重金屬離子的原位高靈敏分析。