大鯢(Andrias davidianus)屬兩棲綱有尾目隱鰓鯢科,為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物,是兩棲綱動(dòng)物的最大物種,也是動(dòng)物進(jìn)化的“活化石”。大鯢屬肉食性動(dòng)物,食性主要為蛋白類食物。大鯢的生長發(fā)育及攝食種類受季節(jié)性影響較大,大鯢是兩棲綱與爬行綱的過渡類群,其消化道結(jié)構(gòu)復(fù)雜,腸道微生物組成多樣。研究大鯢腸道微生物多樣性及產(chǎn)酶活性不僅可以給野生大鯢保護(hù)提供依據(jù),也可以為大鯢人工化養(yǎng)殖預(yù)防病害提供依據(jù)。


本論文研究以野生大鯢與養(yǎng)殖大鯢兩種樣品為實(shí)驗(yàn)材料,通過微生物純培養(yǎng)技術(shù)與免培養(yǎng)技術(shù)全面的分析兩類生境下的大鯢腸道微生物的組成與群落多樣性分析;通過微生物胞外酶研究方法對(duì)兩種樣品進(jìn)行腸道細(xì)菌產(chǎn)胞外酶篩選。野生大鯢腸道微生物多樣性及產(chǎn)酶活性分析采用純培養(yǎng)技術(shù)分離野生大鯢腸道細(xì)菌,選用引物27F/1492R擴(kuò)增后進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。


結(jié)果表明,野生大鯢分離到的86株腸道細(xì)菌可劃分為2個(gè)門6個(gè)屬,變形菌門(Proteobacteria,80.23%):羅維登斯菌屬,愛德華氏菌屬,檸檬酸桿菌屬;厚壁菌門(Firmicutes,19.77%):漫游球菌屬,芽孢桿菌屬,賴氨酸芽孢菌屬。應(yīng)用胞外酶培養(yǎng)基篩選野生大鯢腸道微生物胞外酶活性。結(jié)果表明,野生大鯢分離到的86株腸道細(xì)菌,產(chǎn)蛋白酶(Proteinase)、淀粉酶(Amylase)、纖維素酶(Cellulase)及脂肪酶(Lipase)菌株依次占總數(shù)的96.51%,73.26%,94.19%,5.82%。


采用免培養(yǎng)技術(shù)提取野生大鯢腸道內(nèi)容物總DNA,選用引物799F/1492R進(jìn)行特性擴(kuò)增后連接至載體并轉(zhuǎn)化,選用質(zhì)粒引物M13+/M13-篩選,使用限制性核酸內(nèi)切酶Hae III進(jìn)行(PCR-RFLP)分析后進(jìn)行測(cè)序,并鑒定到屬。結(jié)果表明,野生大鯢腸道細(xì)菌的101個(gè)克隆單元可劃分為3個(gè)門16個(gè)屬,變形菌門(Proteobacteria,94.06%):氣單胞菌屬,不動(dòng)桿菌屬,慢生根瘤菌屬,鞘脂單胞菌屬,德沃斯氏菌屬,假單胞菌屬,勒克菌屬,拉烏爾菌屬,泛菌屬,黃色單胞菌屬,腸桿菌屬;厚壁菌門(Firmicutes,3.96%):梭菌屬,枝芽孢桿菌屬,芽孢菌屬。衣原體門(Chlamydiae,1.98%):嗜衣體屬。


采用免培養(yǎng)技術(shù)提取大鯢腸道總DNA,選用古菌特異性109F/958R和Met86F/Met1340R引物擴(kuò)增后連接至載體pMD-19T并轉(zhuǎn)化,選用質(zhì)粒引物M13+/M13-篩選,使用限制性核酸內(nèi)切酶Afa I進(jìn)行(PCR-RFLP)分析后進(jìn)行測(cè)序,并鑒定。結(jié)果表明,野生大鯢腸道古菌的49個(gè)克隆單元可劃分為1個(gè)門2個(gè)綱,廣古菌門(Euryarchaeota):熱源體綱(Thermoplasmata,12.24%),甲烷菌綱(Methanoplasmatales,4.08%),未分類到綱古菌(Uncultured Archaeon,73.48%)。養(yǎng)殖大鯢腸道微生物多樣性及產(chǎn)酶活性分析采用純培養(yǎng)技術(shù)分離養(yǎng)殖大鯢腸道細(xì)菌,選用引物799F/1492R擴(kuò)增后進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定到屬。


結(jié)果表明,養(yǎng)殖大鯢分離到的97株腸道細(xì)菌可分為3個(gè)門16個(gè)屬,變形菌門(Proteobacteria,87.63%):愛德華氏菌屬,志賀氏菌屬,沙雷氏菌屬,埃希氏菌屬,沙門氏菌屬,肥桿菌屬,鄰單胞菌屬,耶爾辛氏菌屬,腸桿菌屬,孤菌屬,克呂沃氏菌屬,克雷伯氏菌屬,氣單胞菌屬,假單胞菌;厚壁菌門(Firmicutes,7.22%):芽孢桿菌屬;放線菌門(Actinobacteria,5.15%):短桿菌屬。應(yīng)用胞外酶篩選培養(yǎng)基篩選腸道微生物胞外酶活性。結(jié)果表明,養(yǎng)殖大鯢分離到的97株腸道細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶(Proteinase)、淀粉酶(Amylase)、纖維素酶(Cellulase)菌株占總數(shù)的89.69%,73.20%,86.60%。采用免培養(yǎng)技術(shù)提取養(yǎng)殖大鯢腸道內(nèi)容物總DNA,選用引物799F/1492R進(jìn)行特性擴(kuò)增后連接至載體并轉(zhuǎn)化,選用質(zhì)粒引物M13+/M13-篩選并(PCR-RFLP)分析后進(jìn)行測(cè)序,鑒定到屬。


結(jié)果表明,養(yǎng)殖大鯢腸道細(xì)菌的105個(gè)克隆單元可劃分為4個(gè)門15個(gè)屬,變形菌門(Proteobacteria,71.42%):埃希氏菌屬,志賀氏菌屬,沙雷氏菌屬,耶爾辛氏菌屬,食堿菌屬,沙門氏菌屬,哈夫尼菌屬,希萬氏菌屬,布丘氏菌屬;厚壁菌門(Firmicutes,7.62%):芽孢桿菌屬,葡萄球菌屬;放線菌門(Actinobacteria,20.01%):短桿菌屬,戈登氏桿菌屬,紅蝽?xiàng)U菌屬;擬桿菌門(Bacteroidetes,0.95%):理研菌屬。