帶給您多孔微電極陣列應(yīng)用案例分享

光遺傳學(xué)開(kāi)辟了一個(gè)新的讓人激動(dòng)的研究領(lǐng)域，使研究者可以在高時(shí)空分辨率下隨心所欲地控制某些特異類(lèi)型的細(xì)胞。小編這期匯總了全球研究人員利用Maestro multiwell-MEA（多孔微電極陣列）系統(tǒng)配合光遺傳刺激（Lumos）系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)研究的四個(gè)案例，幫助大家了解光遺傳學(xué)與MEA之間可以擦出什么樣的火花。

案例介紹

自主神經(jīng)系統(tǒng)：hiPSC衍生交感和副交感神經(jīng)元協(xié)調(diào)控制心率

來(lái)源：日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所細(xì)胞與分子生物技術(shù)研究部，2020，Scientific Reports

自主神經(jīng)系統(tǒng)(ANS)通過(guò)去甲腎上腺素能交感神經(jīng)的興奮作用和膽堿能副交感神經(jīng)信號(hào)的抑制作用來(lái)調(diào)節(jié)組織的動(dòng)態(tài)平衡和重塑。盡管有許多關(guān)于從人多能干細(xì)胞(hPSCs)誘導(dǎo)交感樣神經(jīng)元的報(bào)道，但還沒(méi)有一種誘導(dǎo)方法能有效地從hPSCs分化出膽堿能副交樣感神經(jīng)元。

本文研究者將傳統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)方法從2步修改為4步誘導(dǎo)出自主神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元，誘導(dǎo)至36天時(shí)，在含有微型隧道的培養(yǎng)板上，可觀察到神經(jīng)元軸突的分化。在誘導(dǎo)52天后，給予表達(dá)ChR2的神經(jīng)元藍(lán)光刺激，跟隨光刺激的時(shí)程，在Maestro MEA系統(tǒng)上會(huì)檢測(cè)到相應(yīng)時(shí)程的神經(jīng)元放電，證明新方法誘導(dǎo)的神經(jīng)元已經(jīng)分化成為具有功能的ANS神經(jīng)元。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，高細(xì)胞密度和低神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可誘導(dǎo)ANS祖細(xì)胞分化成為交感樣神經(jīng)元，相反條件下可以誘導(dǎo)出副交感樣神經(jīng)元。為了檢驗(yàn)這兩種ANS神經(jīng)元是否能對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行精確調(diào)控，研究者先將hiPSC來(lái)源的心肌細(xì)胞種植在Cytoview MEA 6孔板中，再將誘導(dǎo)至13天的交感樣和副交感樣神經(jīng)元分別與心肌細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)。

用藍(lán)光或尼古丁刺激表達(dá)ChR2的交感樣神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，心肌搏動(dòng)頻率顯著增加；而使用尼古丁刺激副交感樣神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，搏動(dòng)頻率明顯降低。單獨(dú)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞使用尼古丁刺激時(shí)，只有微弱的變化。至此，研究者建立了一種從hPSCs中高度選擇性地誘導(dǎo)交感樣和副交感樣神經(jīng)元的方法，促進(jìn)了人ANS神經(jīng)的建模和研究。

脊髓損傷：利用光遺傳學(xué)構(gòu)建斑馬魚(yú)脊髓損傷模型

來(lái)源：美國(guó)斯坦福大學(xué)，2017，SfN poster

復(fù)雜的脊椎動(dòng)物神經(jīng)元的丟失往往伴隨著永久性的功能障礙，所以細(xì)胞消融成為潛在的建立脊髓損傷模型的有效方法?，F(xiàn)有的人工手刺法，具有極大的限制性——會(huì)引入外來(lái)?yè)p傷，并且重復(fù)性差、死亡率高。而光遺傳技術(shù)則可以更精確地控制特定細(xì)胞消融，模擬脊髓損傷。研究者將光敏感蛋白表達(dá)在斑馬魚(yú)的外周神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，使用藍(lán)光刺激誘導(dǎo)細(xì)胞消融后，在Maestro MEA系統(tǒng)中檢測(cè)神經(jīng)元放電狀態(tài)。

與傳統(tǒng)人工方法比較，兩種方法中網(wǎng)絡(luò)簇放電頻率都有不同程度的降低，而平均放電頻率都有不同程度的升高。這表明了利用光遺傳技術(shù)可以成功地建立脊髓損傷模型。該研究為神經(jīng)元環(huán)路的連通性與脊髓損傷病理學(xué)的探索提供了一種新的強(qiáng)有力的檢測(cè)方法。

用光控制收縮：在培養(yǎng)板上控制有功能的人類(lèi)神經(jīng)-肌肉接點(diǎn)

來(lái)源：美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校，2020，bioRxiv

研究者使用ALS病人來(lái)源的iPSC分化成的骨骼肌細(xì)胞和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，建立了神經(jīng)肌肉接頭體外細(xì)胞模型。為了精確控制該細(xì)胞模型，他還將ChR2基因轉(zhuǎn)入運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)，使用Lumos對(duì)樣本進(jìn)行藍(lán)光刺激，并利用MEA系統(tǒng)記錄所得的電信號(hào)。

該結(jié)果顯示，藍(lán)光刺激可使神經(jīng)元產(chǎn)生同步放電，說(shuō)明使用光遺傳學(xué)手段對(duì)神經(jīng)肌肉接頭進(jìn)行精確控制是可行的。研究者分別使用神經(jīng)-肌肉接頭拮抗劑和特殊的多層共培養(yǎng)方法，均可確定記錄到的電活動(dòng)是由神經(jīng)肌肉接頭產(chǎn)生的，而非運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元所產(chǎn)生。最后，他將這種模型用于篩選能改善神經(jīng)肌肉聯(lián)接功能的潛在治療藥物。綜上所述，該體外細(xì)胞模型的建立，為包括ALS在內(nèi)的神經(jīng)肌肉疾病的研究和治療開(kāi)辟了新方向。

神經(jīng)毒理：藥物促癲癇風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的神經(jīng)毒理和藥理研究

來(lái)源：美國(guó)喬治亞理工學(xué)院

在體外功能性神經(jīng)毒理和藥物安全評(píng)估方面，嚙齒類(lèi)動(dòng)物原代神經(jīng)元和iPSC衍生神經(jīng)元已經(jīng)得到廣泛運(yùn)用。但是在開(kāi)展神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)自發(fā)電活動(dòng)測(cè)試時(shí)，相同樣本的不同復(fù)孔間或者不同來(lái)源的細(xì)胞間的定量結(jié)果可能會(huì)有差別，有些促癲癇物質(zhì)對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)放電的影響沒(méi)有被很好地體現(xiàn)出來(lái)。相比之下，誘發(fā)實(shí)驗(yàn)使用可控刺激來(lái)獲得受控結(jié)果，有助于解決孔間一致性問(wèn)題并加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。另外，網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)的頻率和強(qiáng)度這兩個(gè)方面往往是關(guān)聯(lián)的。而使用光遺傳刺激就能夠通過(guò)控制頻率這個(gè)變量來(lái)將強(qiáng)度變量獨(dú)立出來(lái)。

因此，研究者設(shè)計(jì)了成對(duì)刺激實(shí)驗(yàn)，獲得新的誘發(fā)檢測(cè)參數(shù)，可用于癲癇風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估相關(guān)的神經(jīng)毒理和藥理研究。最后，研究者還嘗試設(shè)計(jì)某種刺激模式來(lái)對(duì)應(yīng)生物學(xué)研究中的某個(gè)目標(biāo)，例如使用高頻刺激來(lái)模擬癲癇發(fā)作時(shí)的神經(jīng)活動(dòng)。這一應(yīng)用凸顯了光遺傳刺激的意義。它在精準(zhǔn)控制設(shè)計(jì)上的靈活性，為開(kāi)展神經(jīng)元功能及其機(jī)理研究等實(shí)驗(yàn)提供了便利。