材料和程序

研究地點水樣采集于新喀里多尼亞瀉湖西南部（2000 km2），主要位于努美阿市（125000居民）附近和周圍海灣（圖1）。西南瀉湖的平均深度為21m，主航道的平均深度為25m，而海灣站的深度稍淺（表1）。共有16個站沿3個樣帶取樣，目的是獲得較大的營養(yǎng)范圍。

圖1. 新喀里多尼亞西南瀉湖和研究地點的位置。

“開放瀉湖”樣帶（M03、M05、M08、M10、M12；圖1）的測站因海水通過南部進入而迅速更新（Douillet 1998）。遠離陸地和人為影響，這些站點通常是該地區(qū)營養(yǎng)最貧乏的站點?！笆ガ旣悺睒訋В∟04、N12、N20、N27、N33、M33）位于富營養(yǎng)化的圣瑪麗灣。這個海灣接收周圍城市地區(qū)未經(jīng)處理的廢水。最后，“Grande Rade”站（D01、D05、D08、D16、D22）受到城市污水和鎳工業(yè)污染物的影響。后兩個地點的富營養(yǎng)化程度在海岸和海灣開放之間呈下降趨勢。

由于氧氣測量設(shè)備的可用性，一次只能對一個現(xiàn)場進行取樣。對于每次取樣，使用海鳥SBE 19 CTD探針記錄水柱變量（電導率、溫度、體內(nèi)葉綠素熒光和光合有效輻射）。使用酸洗的5-L Niskin瓶在3m深處采集水樣。先前的工作表明，該取樣深度提供了整個水柱的代表性樣本（Jacquet等人，unpubl.data unref.）。樣品保存在尼斯金瓶中，直到90分鐘內(nèi)返回實驗室。

細菌呼吸返回實驗室后，立即通過125-μm的篩網(wǎng)對600μL的瀉湖水進行預篩選，以消除可能增加整個群落耗氧量變化的較大、較不豐富的生物體。然后將過濾后的水分為兩組水樣：一組用于評估總?cè)郝浜粑奈催^濾水樣和一組過濾到0.6微米孔徑的核孔膜上的水樣。過濾是在低壓差（<100毫米汞柱）下進行的，以避免破壞脆弱的細胞。然后將樣品倒入250ml玻璃瓶中，用穿孔硅塞密封，插入微探針，并在±1°C的原位溫度下在黑暗中孵化。使用磁力攪拌器使水均勻化。每次實驗前，對培養(yǎng)容器、微探針、塞子和攪拌器進行酸洗（鹽酸，最終體積的10%）。

用氧微探針連續(xù)測定呼吸。Microbes（Unisense，丹麥）采用外部保護陰極（Revsbech 1989）設(shè)計，電極本身的耗氧量極低（4.7至47×10–7 mmol O2 h–1）。探針的響應時間小于1s，精度為0.1μM。在14h（圣瑪麗和格蘭德拉德樣品）或24h（開放瀉湖樣品）期間，每10s由計算機收集一次氧濃度。根據(jù)0.6μm過濾水樣中的耗氧量估算細菌呼吸。根據(jù)5小時內(nèi)測量的O2與時間的斜率計算細菌呼吸，我們假設(shè)該斜率足夠短，以盡量減少細菌的產(chǎn)生和數(shù)量變化。從觀察到氧氣顯著減少（0.5μM）中選擇起始點。假設(shè)呼吸商為1，將耗氧量轉(zhuǎn)換為呼吸碳量（μgC L–1 h–1）。

未過濾樣品中的葉綠素a-葉綠素a濃度在過濾到GF/F過濾器后測定，該過濾器立即儲存在-20°C下，直至分析。葉綠素a濃度后來根據(jù)Yentsch和Menzel方法（1963年）進行熒光測定。色素濃度由Lorenzen（1966）計算得出，Jeffrey和Humphrey（1975）對其進行了修改。

細菌豐度細菌豐度從立即用硼砂緩沖福爾馬林（2%最終濃度）保存的樣品中估算，過濾到0.2μm黑色聚碳酸酯膜上，用DAPI（4′6-二氨基-2-苯基吲哚）染色，并在-20°C下儲存，直到熒光顯微鏡下計數(shù)。在至少20個字段中重復計數(shù)400多個細菌，以獲得10%的變異系數(shù)（Kirchman等人，1982年）。在每次呼吸培養(yǎng)開始和結(jié)束時測定細菌豐度。

3H-胸腺嘧啶核苷的摻入細菌DNA合成，通過將3H-胸腺嘧啶核苷摻入冷三氯乙酸（TCA）可沉淀材料中來測定細菌產(chǎn)量。在原位溫度（±1°C）下，用3H-[甲基]胸苷（最終濃度15 nM，1.8 TBq mmol–1，Amersham）在黑暗中培養(yǎng)5至10 mL水樣的兩份或三份，培養(yǎng)1 h。以前的實驗表明，在這個濃度下，總是能達到飽和。通過添加緩沖福爾馬林（最終濃度為2%）停止活性。通過0.2-μm聚碳酸酯膜在低壓（<100 mm Hg）下過濾收集標記材料，并允許其在4°C下用冰冷TCA（5%w/v）沉淀15分鐘。用5毫升5%冷TCA沖洗膜3次。然后用0.5 N HCl在100°C下加熱30分鐘水解DNA。加入4 mL閃爍雞尾酒后，在淬火校正后，用Packard TriCarb閃爍計數(shù)器測量放射性。在每次呼吸培養(yǎng)開始和結(jié)束時測定細菌DNA合成。3H-胸腺嘧啶核苷摻入率使用2.91×1018細胞mol–1胸腺嘧啶核苷的轉(zhuǎn)換因子轉(zhuǎn)換為細胞產(chǎn)量（Jacquet unpubl.數(shù)據(jù)unref.）。

BGE測定一般情況下，BGE是根據(jù)從短培養(yǎng)時間（即~1小時）測定的胸腺嘧啶核苷或亮氨酸摻入估計的細菌產(chǎn)量，以及從培養(yǎng)24小時后測得的細菌呼吸（使用溫克勒O2滴定法）計算得出的。在本研究中，BGE的計算公式如下：

BBPnet為凈細菌生物量生產(chǎn)量，即所考慮的培養(yǎng)時間開始和結(jié)束之間的細菌生物量差異，BR為細菌呼吸，以碳單位轉(zhuǎn)換。細菌豐度（106個細胞mL-1）到碳生物量（μg C L-1）的轉(zhuǎn)換是使用20個fgC細胞-1的轉(zhuǎn)換因子完成的（Lee和Fuhrman 1987），盡管該因子仍存在相當大的不確定性（Fukuda et al.1998）。

使用氧微電極來研究細菌的呼吸作用以確定浮游細菌的生長速率——摘要

使用氧微電極來研究細菌的呼吸作用以確定浮游細菌的生長速率——材料和程序

使用氧微電極來研究細菌的呼吸作用以確定浮游細菌的生長速率——看法

使用氧微電極來研究細菌的呼吸作用以確定浮游細菌的生長速率——討論、意見和建議！