2.2 Fe-CDs的光譜性質

通過紫外可見吸收光譜儀和熒光光譜儀表征Fe-CDs的光譜性能。如圖4（a）所示，在紫外可見吸收光譜中Fe-CDs在300 nm和425 nm附近表現(xiàn)出明顯的寬吸收峰，分別歸因于Fe-CDs內(nèi)核共軛體系的π→π*躍遷，及表面多種官能團的n→π*躍遷。從熒光光譜可以看出Fe-CDs的最佳激發(fā)和發(fā)射波長分別為449 nm和571 nm。Fe-CDs在紫外燈照射下可以看到明亮的黃色熒光。從不同激發(fā)波長下Fe-CDs的發(fā)射光譜數(shù)據(jù)（圖4b）可以看到，當激發(fā)波長由390 nm增加到550 nm時，F(xiàn)e-CDs的熒光發(fā)射波長幾乎沒有明顯的變化，熒光強度先增加后下降，表明Fe-CDs的發(fā)光性質是激發(fā)波長獨立性的，這可能是由于Fe-CDs的粒徑及發(fā)射中心相對均勻的原因。另外，相較于其他金屬摻雜碳點，F(xiàn)e-CDs表現(xiàn)出高的熒光量子產(chǎn)率，以羅丹明6G（乙醇中QY=95%）為參照，其量子產(chǎn)率可達26.80%（表1）。

圖4（a）Fe-CDs的紫外-可見吸收光譜和熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜；（b）在不同激發(fā)波長激發(fā)下Fe-CDs的熒光發(fā)射光譜

表1不同金屬摻雜碳點的熒光量子產(chǎn)率對比

為了研究Fe-CDs的熒光穩(wěn)定性，考察了不同離子強度、金屬離子及氨基酸對Fe-CDs熒光強度的影響。如圖5（a），以不同濃度NaCl溶液模擬不同離子強度環(huán)境，當NaCl溶液濃度高達到2.0 mol/L時，熒光強度依然可維持原始熒光強度的90%以上，表明Fe-CDs具有良好的離子穩(wěn)定性和抗鹽能力。如圖5（b）和5（c）所示，當Fe-CDs分別與15種不同的金屬離子及17種不同的氨基酸共存時，F(xiàn)e-CDs熒光強度幾乎不受各種共存物質的影響，表明Fe-CDs有比較強的光穩(wěn)定性。

圖5（a）不同濃度的鹽溶液對Fe-CDs熒光強度的影響；（b）不同金屬離子對Fe-CDs熒光強度的影響；（c）不同氨基酸對Fe-CDs熒光強度的影響

2.3 Fe-CDs熒光探針檢測pH

pH在很大程度上影響著機體的正常功能，開發(fā)用于監(jiān)測細胞內(nèi)pH變化的新型熒光探針對于研究pH影響的相關的疾病具有重要意義。由于Fe-CDs表面存在豐富的活性官能團，我們探索了其在傳感器領域的潛在應用。如圖6（a）所示，F(xiàn)e-CDs在酸性環(huán)境下的熒光強度隨著pH的減小逐漸降低（λex=449 nm，λem=571 nm）。當pH降低至2時，F(xiàn)e-CDs 95%的熒光強度被猝滅；當pH為7時Fe-CDs熒光強度達到最高值。在堿性環(huán)境下，隨著pH的逐漸增大，F(xiàn)e-CDs熒光強度變化不大。通過玻爾茲曼函數(shù)擬合曲線，得到Fe-CDs的pKa為5.32，且在pH 4.4～6.2范圍內(nèi)，F(xiàn)e-CDs熒光強度與pH具有良好的線性相關性，y=4086 pH-16 800.5（圖6b）。上述實驗結果證明Fe-CDs可作為監(jiān)測酸性條件下pH變化的新型熒光探針。

圖6 Fe-CDs隨pH值的熒光強度變化（a）pH為2～12的熒光強度變化；（b）pH為2～7范圍的熒光強度變化

通過檢測不同pH下的Fe-CDs的Zeta電位、熒光壽命及紫外吸收光譜，研究了Fe-CDs檢測pH的作用機理。由Zeta電位結果可知，pH從7降至2時，隨著體系中H+濃度的升高Fe-CDs的所帶電荷由-9.39 mV升高至16.6 mV。同時Fe-CDs的熒光壽命由1.70 ns升高至2.23 ns（圖7a）。從紫外吸收光譜可知，隨著pH的逐漸減小，F(xiàn)e-CDs在425 nm處的吸收峰逐漸紅移至450 nm（圖7b）。因此，推測Fe-CDs表現(xiàn)出pH依賴的熒光特性可能是由于pH值的變化導致Fe-CDs中π→π*和n→π*電子躍遷變化引起的，F(xiàn)e-CDs表面的羧基、氨基等官能團的質子化和解質子化造成其費米能級的偏移使其表現(xiàn)出pH依賴的熒光特性。

圖7（a）Fe-CDs在pH為2、7時的熒光衰減曲線；（b）在不同pH環(huán)境中Fe-CDs的紫外吸收光譜

2.4 Fe-CDs的細胞毒性及其在細胞成像中的應用

通過上述研究證明，F(xiàn)e-CDs可作為監(jiān)測酸性條件下pH變化的新型熒光探針，在成像應用中具有發(fā)展?jié)摿ΑＪ紫?，我們選用人宮頸癌HeLa細胞為模型，采用MTT標準法檢測Fe-CDs的細胞毒性。如圖8中所示，用不同濃度的Fe-CDs與HeLa細胞共孵育24 h后，即使Fe-CDs的濃度達到300μg/mL，HeLa細胞的存活率仍高于85%，說明Fe-CDs毒性非常低，具有良好的生物相容性，可有效應用于體內(nèi)細胞成像。

圖8不同濃度Fe-CDs與HeLa細胞共孵育24 h后細胞的存活率

由于Fe-CDs具有良好的光學性能及穩(wěn)定的生物相容性，探索了其作為熒光探針在監(jiān)測細胞內(nèi)pH的可能性。用人宮頸癌HeLa細胞為模型，將濃度為0.1 mg/mL的不同pH值的（pH=2，5，7）Fe-CDs與HeLa細胞共孵育半小時進行細胞成像實驗，觀察細胞形態(tài)變化以及細胞內(nèi)熒光變化。如圖9所示，F(xiàn)e-CDs分布于細胞膜、細胞質甚至細胞核區(qū)域，說明Fe-CDs具有良好的細胞通透性。當pH為7時，細胞內(nèi)的熒光強度最強（c和f）；當pH為5時，F(xiàn)e-CDs的熒光強度部分猝滅（b和e）；當pH為2時，F(xiàn)e-CDs的熒光強度幾乎全部被猝滅（a和d）。這與體外實驗結果一致，也進一步表明了Fe-CDs可作為一種良好的pH熒光探針用于細胞內(nèi)pH水平的監(jiān)測。

3結論

該工作以鄰苯二胺及生物分子血紅素為原料，通過一步水熱法制備得到鐵摻雜熒光碳點（Fe-CDs）。由于原料中的血紅素具有大環(huán)結構，利于碳點在合成過程形成大的共軛平面；并且微量的鐵元素摻雜有助于改變碳點的電荷分布，進而大幅提高了碳點的熒光量子產(chǎn)率，可達26.8%。同時，F(xiàn)e-CDs展現(xiàn)出良好的水溶性，穩(wěn)定的光學性能，優(yōu)異的抗鹽及抗干擾能力。由于其表面豐富的氨基、羧基等官能團及鐵元素的摻雜，F(xiàn)e-CDs可以作為熒光探針用于酸性環(huán)境下的pH檢測。同時Fe-CDs具有低毒性且易于被細胞攝取，可實現(xiàn)細胞內(nèi)pH的熒光成像應用。以上研究證明Fe-CDs作為一種制備簡便、性能優(yōu)異的熒光探針在生物傳感領域具有良好的應用潛力。