2.2溫度對Anammox-DAMO系統(tǒng)N2O產(chǎn)消過程中EPS的影響

2.2.1溫度對Anammox-DAMO系統(tǒng)EPS變化的影響EPS是一種高分子量聚合物，主要由多糖（PS）和蛋白質(zhì)（PN）組成，可用作保護(hù)層，以減弱惡劣環(huán)境對微生物的脅迫。此外，EPS在微生物的生物膜形成?粒化和穩(wěn)定性中起重要作用。由圖5可知，兩個(gè)系統(tǒng)中PN含量的變化占主導(dǎo)地位，PS含量整體變化幅度并不明顯，PN含量隨著時(shí)間的推移先升高后降低，這是由于該體系在試驗(yàn)前期需要通過增加PN含量來維持穩(wěn)定性。與R1系統(tǒng)不同，在R2系統(tǒng)中，PN含量在中、后期都較初期有更大的增加幅度。

圖5 Anammox-DAMO系統(tǒng)中EPS含量變化

總體而言，R2系統(tǒng)在中后期PN和PS的含量都高于R1系統(tǒng)，隨著溫度的增加，蛋白質(zhì)和多糖溶解并從污泥中釋放出來。R2系統(tǒng)中PN的量要比R1系統(tǒng)顯著高很多（P<0.05），這是由于高溫脅迫下導(dǎo)致R2系統(tǒng)產(chǎn)生更多的PN以適應(yīng)環(huán)境條件。在整個(gè)過程中，各組PN均高于PS,這與其他研究相似0,4.結(jié)果表明，R2系統(tǒng)中期的EPS與初期對比起來有所增加，PS含量穩(wěn)定在4.9mg/L,PN含量由6.6增加到11.3mg/L,可見，相較于PS,高溫沖擊對PN的影響程度更大，這主要?dú)w因于微生物對惡劣環(huán)境的自我保護(hù)機(jī)制。作為影響細(xì)胞表面電荷和疏水性的一個(gè)因素，較高的PN提高了Anammox-DAMO系統(tǒng)中微生物的粘附性，并減輕了溫度沖擊對Anammox-DAMO系統(tǒng)微生物的損傷。

R2系統(tǒng)在高溫脅迫下產(chǎn)生更多的EPS,導(dǎo)致N2O擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的傳質(zhì)阻力增加，N2O還原酶的作用時(shí)間縮短使得N2O排放量升高，這與Sabba等的研究結(jié)果一致。

2.2.2溫度對Anammox-DAMO系統(tǒng)可溶性蛋白影響圖6（a）和6（b）為初期（0d）的三維熒光圖，發(fā)現(xiàn)發(fā)射峰位于300——350nm處，激發(fā)峰位于250——300nm處，通過與其他研究中熒光組分的激發(fā)和發(fā)射最大值位置進(jìn)行比較，該范圍內(nèi)顯示熒光激發(fā)峰的物質(zhì)為蛋白質(zhì)5-4,其中激發(fā)峰在250——340nm,發(fā)射峰在280——380nm處主要包含物為酪氨酸和色氨酸。激發(fā)峰在220——340nm,發(fā)射峰在380——520nm處主要包含物為腐殖酸7-5.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知初期實(shí)驗(yàn)測得的主要物質(zhì)是酪氨酸/色氨酸。

圖6溫度對Anammox-DAMO系統(tǒng)可溶性蛋白影響

從圖6（c）中可知，R1系統(tǒng)三維熒光發(fā)射峰位于300——400nm處，激發(fā)峰位于250——350nm處，主要物質(zhì)為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物以及多糖。圖6（d）顯示R2系統(tǒng)三維熒光發(fā)射峰位于300——450nm處，激發(fā)峰位于200——350nm處，主要物質(zhì)為酪氨酸/色氨酸、微生物代謝物、多糖以及富里酸。由圖中可得出EPS中蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度明顯大于多糖?腐殖酸，說明系統(tǒng)中微生物更多的產(chǎn)生蛋白質(zhì)來適應(yīng)溫度變化對其影響。且R2系統(tǒng)中期的熒光信號(hào)要明顯強(qiáng)于初期，并且強(qiáng)于同時(shí)期的R1系統(tǒng)的熒光信號(hào)，表明高溫會(huì)對反應(yīng)器中的微生物活動(dòng)產(chǎn)生影響，從而干擾有機(jī)物的分泌，產(chǎn)生更多的酪氨酸/色氨酸。有研究表明色氨酸類和酪氨酸類蛋白質(zhì)物質(zhì)與N2O的排放量呈顯著正相關(guān)關(guān)系1-5,因此R2系統(tǒng)中更高的N2O產(chǎn)生量可歸因于更多酪氨酸/色氨酸的生成。

從圖6（e）可知R1系統(tǒng)三維熒光發(fā)射峰位于300——400nm處，激發(fā)峰位于200——350nm處，主要物質(zhì)為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物以及多糖。圖6（f）顯示R2系統(tǒng)三維熒光發(fā)射峰位于300——400nm處，激發(fā)峰位于250——350nm處，主要物質(zhì)為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物?多糖。R2系統(tǒng)末期的熒光信號(hào)與中期相比逐漸減弱，逐漸恢復(fù)到初期水平，并與R1系統(tǒng)的熒光信號(hào)無顯著性差異，表明R2中的微生物逐漸適應(yīng)高溫環(huán)境，這與系統(tǒng)性能的惡化與恢復(fù)趨勢一致。

2.3溫度影響下Anammox-DAMO系統(tǒng)N2O產(chǎn)消的生物學(xué)機(jī)制

2.3.1溫度對Anammox-DAMO系統(tǒng)微生物群落變化的影響如圖7（a）所示，R1和R2的優(yōu)勢菌門均為Proteobacteria,且分別占比33%和40%,它是厭氧氨氧化系統(tǒng)常見的一大門類，且有研究表明Proteobacteria大多數(shù)是反硝化細(xì)菌，并且Proteobacteria中的大部分菌可以參與甲烷氧化過程，普遍存在于污水處理廠脫氮除磷工藝中。第二優(yōu)勢菌門是Chloroflexi,分別占比14%和17%,它的作用是在細(xì)胞生長過程中降解有機(jī)分子或分泌可溶性化合物。在溫度的影響下，R2系統(tǒng)中的Firmicutes、Chloroflexi、Bacteroidetes和Euryarchaeota等嗜熱微生物豐度上升。相反在高溫脅迫下Actinobacteria和Ignavibacteriae的豐度相比R1有所下降，說明高溫環(huán)境不利于其生存。

圖7微生物相對豐度分布

圖7（b）顯示2個(gè)系統(tǒng)中均發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonad）、食酸菌屬（Acidovorax）、陶厄氏菌屬（Thauera）、甲基單胞菌屬（Methylomonas）、Methanoperedens nitroreducens、叢毛單胞菌屬（Comamonadaceae）、特呂珀菌屬（Truepera）、Kuenenia、甲烷微菌屬（Methylomicrobium）。Acidovorax是常見的反硝化菌，Thauera是自養(yǎng)型反硝化細(xì)菌4-5,相比于R1系統(tǒng)，這兩種菌屬豐度在R2系統(tǒng)中均有所下降，表明高溫環(huán)境會(huì)抑制其生長。Tanikawa等認(rèn)為Acidovorax和Thauera是反硝化過程中主要的N2O還原劑，Zhao等在Thauera中檢測到了大部分N2O還原酶編碼基因，證明了Thauera在N2O還原過程中的巨大貢獻(xiàn)，R2系統(tǒng)中Thauera豐度的下降是N2O積累量更多的原因。另外，有研究證明Bacillus可能在N2O排放方面發(fā)揮巨大作用，本文在R2系統(tǒng)中檢測到了該屬更高的豐度，這也是導(dǎo)致N2O排放量更高的重要原因。Methylomonas中存在亞硝酸鹽還原酶，其在R2系統(tǒng)中的豐度明顯低于R1系統(tǒng)，導(dǎo)致R2系統(tǒng)亞硝酸鹽大量積累。Methanoperedens nitroreducens已知為進(jìn)行硝酸鹽驅(qū)動(dòng)的厭氧甲烷氧化的n-DAMO古菌，在R1系統(tǒng)中的占比為23.22%,在R2系統(tǒng)中的占比為16.40%,由此可見高溫抑制了DAMO古菌的生長，造成脫氮速率下降。Ca.Kuenenia和Ca.Brocadia與脫氮直接相關(guān)，是常見的Anammox細(xì)菌，在R1系統(tǒng)中兩者的占比分別為17.64%和12.47%,在R2系統(tǒng)中兩者的占比分別為19.01%和16.65%,可以看出Anammox兩個(gè)菌屬在R2中占比升高。這可能是因?yàn)镈NRA反應(yīng)產(chǎn)生的銨促進(jìn)了Anammox微生物的生長。在兩個(gè)系統(tǒng)中均未檢測到能夠進(jìn)行DNRA反應(yīng)的典型微生物，因此推測DAMO古菌利用甲烷厭氧氧化產(chǎn)生的電子發(fā)生了DNRA反應(yīng)。

2.3.2溫度對Anammox-DAMO系統(tǒng)微生物功能基因豐度變化影響反硝化過程主要由4種酶催化，即硝酸鹽還原酶（narGHI/napAB）、亞硝酸鹽還原酶（nirK/nirS）、NO還原酶（norBC）和N2O還原酶（nosZ）。nrfA是DNRA的分子標(biāo)志物，由圖8可見，其在R2系統(tǒng)中相對豐度較高，對高溫條件表現(xiàn)出明顯的偏好性，Lai等將溫度從10℃提升到40℃時(shí)，nrfA基因豐度增加，DNRA反應(yīng)過程增強(qiáng)，說明DNRA反應(yīng)與nrfA基因豐度呈顯著正相關(guān)。對于硝酸還原酶基因，相較于R1系統(tǒng)，R2系統(tǒng)中的napAB轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)，顯示了對DNRA的主要貢獻(xiàn)（硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽），然而narGHI的表達(dá)水平與R1系統(tǒng)幾乎一致，表明對部分DNRA的貢獻(xiàn)較小。對于亞硝酸還原酶基因，nirSK在R2系統(tǒng)中的相對豐度低于R1系統(tǒng)，減弱了R2系統(tǒng)對亞硝酸鹽還原能力進(jìn)而導(dǎo)致亞硝酸鹽積累，這主要?dú)w因于高溫會(huì)顯著降低nirK基因的豐度。另外，在R2系統(tǒng)中，NO還原酶基因（norB）相對豐度更高，而N2O還原酶基因（nosZ）相對豐度較低，說明高溫條件抑制了nosZ酶的生成，進(jìn)而阻礙了N2O被還原。hdh和hzs是參與Anammox反應(yīng)的酶，其中hzs在R2中的相對豐度高于R1系統(tǒng)，且與nrfA的變化呈正相關(guān)關(guān)系，表明DNRA反應(yīng)產(chǎn)生的銨為Anammox提供了底物，從而促進(jìn)Anammox過程的發(fā)生。

圖8不同溫度下氮代謝和碳代謝功能基因豐度

在R2系統(tǒng)中，Anammox基因豐度高，但脫氮性能卻比R1差。這種現(xiàn)象可以通過不利的溫度和FNA對轉(zhuǎn)錄、翻譯和酶活性的抑制來解釋。以亞硝酸鹽還原酶與N2O還原酶的比值（Σnir/nos）作為N2O產(chǎn)生潛力的指標(biāo)，其中Σnir/nos是由nir基因（nirS+nirK）之和除以nos基因測定的。結(jié)果表明R2系統(tǒng)中Σnir/nosZ（1.95）高于R1系統(tǒng)（1.49），說明Anammox-DAMO系統(tǒng)在高溫脅迫下更易積累N2O.

2.4溫度影響下Anammox-DAMO系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)機(jī)制及N2O減排調(diào)控策略

2.4.1溫度影響下Anammox-DAMO系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)機(jī)制如圖9及表1、2、3所示，NO3-、NH4+和N2O酶動(dòng)力學(xué)方程中Vmax均隨著溫度的升高先增大后減小，在35℃時(shí)最大，40℃時(shí)最小，意味著硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、N2O還原酶均在35℃時(shí)擁有最大比合成/活化速率，酶活性最強(qiáng)。KI,R為對應(yīng)還原酶的抑制系數(shù)，3種酶動(dòng)力學(xué)方程的KI,R隨溫度的升高先降低后升高，同樣在35℃時(shí)最大，40℃時(shí)最小，表明35℃的溫度條件對3種酶的抑制作用最小。3種酶動(dòng)力學(xué)方程的半飽和常數(shù)KE,i隨著溫度的升高先減少后增加，在35℃時(shí)最小，40℃時(shí)最大。

表1不同溫度下NO3-降解酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表2不同溫度下NH4+降解酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表3不同溫度下N2O消耗酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖9酶動(dòng)力學(xué)擬合曲線

硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、N2O還原酶的活性均隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢，且在35℃時(shí)活性達(dá)到最大，意味著在此溫度下Anammox-DAMO系統(tǒng)的脫氮性能最好，N2O還原效果最好，能夠?qū)崿F(xiàn)最大程度減少N2O排放量。低于或高于35℃的溫度條件都會(huì)對酶的活性產(chǎn)生不利影響，造成系統(tǒng)性能的惡化以及N2O的積累，擬合結(jié)果印證了短期試驗(yàn)結(jié)果。Hu等利用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的缺氧/好氧間歇式反應(yīng)器探究了溫度對N2O排放的影響，結(jié)果表明在10——35℃的溫度條件下，N2O排放量隨溫度的升高而降低，該系統(tǒng)主要是通過溫度變化影響硝化和反硝化的總體過程速率來影響N2O的排放，本研究在該溫度范圍的基礎(chǔ)上繼續(xù)擴(kuò)大溫度范圍，發(fā)現(xiàn)在20——40℃的范圍內(nèi)，系統(tǒng)在35℃時(shí)出現(xiàn)N2O排放低谷。此外，Qian等在TDD-Anammox耦合工藝中發(fā)現(xiàn)35℃時(shí)系統(tǒng)N2O排放量最少，這主要?dú)w因于Anammox微生物（其特征是不產(chǎn)生N2O）在此溫度下發(fā)揮最大作用，而本研究酶動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果證明了參與Anammox過程的亞硝酸鹽還原酶在35℃下活性最大，與其實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

綜上所述，動(dòng)力學(xué)模型可以很好地預(yù)測系統(tǒng)在不同溫度下N2O排放情況，根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果推測出N2O排放量最少的溫度條件為35℃，在此溫度下該系統(tǒng)可以最大程度地實(shí)現(xiàn)N2O減排。

2.4.2 Anammox-DAMO系統(tǒng)代謝途徑及N2O調(diào)控策略根據(jù)檢測到的功能菌和基因，通過比對KEGG數(shù)據(jù)庫的注釋對溫度影響下Anammox-DAMO系統(tǒng)特殊氮代謝途徑進(jìn)行分析（圖10）。

圖10 Anammox-DAMO系統(tǒng)特殊氮代謝途徑

在Anammox-DAMO系統(tǒng)中，除已被證實(shí)的Anammox-DAMO氮代謝基因，還檢測到了與DNRA反應(yīng)相關(guān)的nrfA基因，且在高溫脅迫下其豐度顯著增加。研究表明DAMO古菌有編碼nrfA的基因，因此具有發(fā)生DNRA反應(yīng)的潛力。高溫抑制了Anammox-DAMO系統(tǒng)中nir酶的活性，造成亞硝酸鹽積累，基于nrfA的解毒機(jī)制，此時(shí)nrfA會(huì)將NO2-還原為NO,nrfA與活性位點(diǎn)血紅素c基團(tuán)A結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)將NO轉(zhuǎn)化為N2O.在本研究中還檢測到了與N2O產(chǎn)消相關(guān)的norB、norC和nosZ基因。有研究表明，Anammox細(xì)菌會(huì)生成中間產(chǎn)物NO,norB和norC基因可能會(huì)對外部亞硝化應(yīng)激做出快速反應(yīng)，為了將NO維持在毒性水平以下會(huì)把NO轉(zhuǎn)化為N2O.高溫影響下，Anammox細(xì)菌產(chǎn)生的NO促進(jìn)了norBC基因豐度增加，進(jìn)而將更多的NO轉(zhuǎn)化為N2O.與此同時(shí)，Anammox-DAMO系統(tǒng)中的nosZ基因豐度降低，說明高溫抑制了N2O還原酶的生成，導(dǎo)致無法及時(shí)將產(chǎn)生的N2O還原，造成N2O凈排放量升高。綜上所述，N2O產(chǎn)生和消耗途徑可作如下解釋：Anammox-DAMO系統(tǒng)中檢測到的N2O由DNRA反應(yīng)及Anammox細(xì)菌對NO解毒作用產(chǎn)生，而N2O的消耗大部分由編碼nosZ基因的微生物完成。

基于Anammox-DAMO系統(tǒng)中N2O特殊的產(chǎn)消代謝途徑，本研究發(fā)現(xiàn)高濃度亞硝酸鹽脅迫是導(dǎo)致Anammox-DAMO系統(tǒng)N2O積累的主要原因。高溫通過影響系統(tǒng)氮代謝過程中的關(guān)鍵功能基因酶的活性，導(dǎo)致亞硝酸鹽濃度升高，進(jìn)而觸發(fā)DNRA反應(yīng)及Anammox細(xì)菌的解毒作用。反硝化過程中4個(gè)還原步驟之間的電子競爭以及不同還原酶的活性決定了N2O的積累程度，本研究中，對系統(tǒng)性能不利的高溫條件會(huì)顯著降低N2O還原酶的活性，導(dǎo)致N2O的凈排放量升高。因此，盡可能控制系統(tǒng)在運(yùn)行過程中維持在中溫條件，豐富具有較強(qiáng)N2O還原能力的微生物群，可以促進(jìn)N2O的還原。在后續(xù)研究中，還需要優(yōu)化pH值、C/N、DO、FNA等其他操作條件，避免運(yùn)行過程中亞硝酸鹽的積累，并研究不同操作條件下N2O還原酶的活性，以最大限度地減少廢水處理中N2O的產(chǎn)生。

3結(jié)論

3.1高溫顯著降低了Anammox-DAMO系統(tǒng)的脫氮性能，且在高溫脅迫下系統(tǒng)中亞硝酸鹽積累進(jìn)而導(dǎo)致N2O的凈排放量升高，根據(jù)甲烷與硝酸鹽降解速率比值可知該系統(tǒng)在長期運(yùn)行過程中還存在DNRA反應(yīng)。

3.2 Anammox-DAMO系統(tǒng)中微生物在高溫脅迫下產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)以緩解惡劣環(huán)境造成的損傷，三維熒光光譜結(jié)果顯示其主要為色氨酸類和酪氨酸類蛋白質(zhì)物質(zhì)，該類物質(zhì)的分泌與N2O的排放量呈顯著正相關(guān)。

3.3高通量測序結(jié)果表明，在高溫影響下系統(tǒng)中與N2O還原相關(guān)的Acidovorax和Thauera屬豐度降低，而與N2O產(chǎn)生相關(guān)的Bacillus屬豐度則上升。宏基因測序結(jié)果表明高溫降低了nirSK豐度，造成亞硝酸鹽積累，此外在高溫條件下norB豐度增加而nosZ豐度減少，加速了N2O生成的同時(shí)抑制了其還原，導(dǎo)致N2O積累。

3.4在不同溫度下對Anammox-DAMO系統(tǒng)進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)擬合，發(fā)現(xiàn)低溫和高溫均會(huì)增加N2O的凈排放量，而在35℃時(shí)可以最大程度地實(shí)現(xiàn)N2O減排。