研究簡(jiǎn)介:介紹了卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）的生物學(xué)特性及其在人類健康中的重要性，特別是它在引起呼吸道疾病方面的作用。文章強(qiáng)調(diào)了卡他莫拉菌從先前被認(rèn)為是無(wú)害的上呼吸道共生菌，到現(xiàn)在被確認(rèn)為能夠引起上下呼吸道疾病，包括在嬰幼兒中常見(jiàn)的急性中耳炎，以及在成人中可能導(dǎo)致慢性阻塞性肺?。–OPD）的感染性加重。本研究重點(diǎn)放在了卡他莫拉菌的生物膜生長(zhǎng)模式，這是一種在黏膜表面與其他共生細(xì)菌共同存在的形態(tài)。在生物膜中，特定的基因表達(dá)會(huì)上調(diào)，包括與反硝化途徑相關(guān)的基因。反硝化是一種細(xì)菌在缺氧條件下利用氮氧化物作為電子受體進(jìn)行代謝的過(guò)程。在卡他莫拉菌中，研究者發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)關(guān)鍵的開(kāi)放閱讀框（ORFs），aniA和norB，它們編碼的蛋白質(zhì)分別參與亞硝酸鹽和一氧化氮的還原過(guò)程。nsrR基因編碼了一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，對(duì)aniA和norB基因的表達(dá)具有抑制作用。當(dāng)nsrR基因被失活時(shí)，aniA和norB的表達(dá)增加，這與亞硝酸鹽對(duì)卡他莫拉菌生長(zhǎng)的抑制有關(guān)。


研究還發(fā)現(xiàn)，nsrR基因的突變體在亞硝酸鹽存在下的生長(zhǎng)受到抑制，但這種抑制可以通過(guò)aniA基因的突變或nsrR基因的互補(bǔ)來(lái)逆轉(zhuǎn)。增進(jìn)了我們對(duì)卡他莫拉菌如何在宿主中生存和致病的理解，而且可能為開(kāi)發(fā)新的治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)。通過(guò)了解這些基因和它們?cè)诩?xì)菌適應(yīng)和致病過(guò)程中的作用，我們可以更好地控制和預(yù)防由卡他莫拉菌引起的感染。


Unisense微電極分析系統(tǒng)的應(yīng)用


Unisense微電極分析系統(tǒng)被用于定量測(cè)量卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）在不同條件下對(duì)氮氧化物的代謝活動(dòng)。首先將卡他莫拉菌的野生型和突變型菌株在BHI肉湯中培養(yǎng)至OD600（光學(xué)密度在600納米處）達(dá)到2.0，然后洗滌并重新懸浮在新鮮的BHI肉湯中至OD600為1.0。為了研究亞硝酸鹽（NO2-）的代謝，向細(xì)胞懸浮液中添加最終濃度為5 mM的NaNO2。使用氧氣不敏感的、N2O特異性的探針（N2O-50-3112）連接到皮安表（PA2000），并通過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換器（ADC 216）記錄數(shù)據(jù)。在添加NaNO2后，監(jiān)測(cè)細(xì)胞懸浮液中N2O的產(chǎn)生。收集不同時(shí)間點(diǎn)的N2O的濃度數(shù)據(jù)，以評(píng)估卡他莫拉菌對(duì)這些氮氧化物的代謝速率和途徑。


實(shí)驗(yàn)結(jié)果


研究確定了NsrR是一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它在卡他莫拉菌中調(diào)控著一個(gè)截?cái)嗟姆聪趸緩健srR通過(guò)抑制aniA和norB兩個(gè)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控亞硝酸鹽還原酶和一氧化氮還原酶的活性。在nsrR基因失活的情況下，aniA和norB基因的表達(dá)顯著上調(diào)，這表明NsrR對(duì)這些基因具有負(fù)調(diào)控作用。這種調(diào)控對(duì)卡他莫拉菌在不同環(huán)境條件下的生存和適應(yīng)至關(guān)重要。nsrR基因的突變體在低水平的亞硝酸鹽存在下生長(zhǎng)受到抑制，這種抑制可以通過(guò)aniA基因的突變或nsrR基因的互補(bǔ)來(lái)逆轉(zhuǎn)。這表明NsrR在調(diào)節(jié)卡他莫拉菌對(duì)亞硝酸鹽的敏感性方面發(fā)揮著重要作用。通過(guò)使用微電極技術(shù)和分子生物學(xué)方法，揭示了卡他莫拉菌能夠通過(guò)AniA和NorB蛋白分別還原亞硝酸鹽和一氧化氮，并且能夠?qū)⒁谎趸M(jìn)一步還原為一氧化二氮。卡他莫拉菌可能利用其截?cái)嗟姆聪趸緩皆谘跸拗茥l件下更有效地呼吸，并保護(hù)自己免受宿主防御機(jī)制產(chǎn)生的一氧化氮的侵害。這項(xiàng)研究增進(jìn)了我們對(duì)卡他莫拉菌如何在宿主中生存、適應(yīng)并引起疾病的理解，為開(kāi)發(fā)新的防治策略提供了可能的靶點(diǎn)。

圖1、參與截短脫氮途徑的卡他莫拉菌基因產(chǎn)物示意圖及相關(guān)突變體的構(gòu)建。(A)卡他莫拉菌的截短脫氮途徑包括所示的前三個(gè)酶解步驟?？ㄋ@然缺乏將N2O還原為N2的能力(用括號(hào)表示)。(B至D)包含norB、nsrR和aniA基因的卡他莫拉菌染色體位點(diǎn)示意圖，(B)野生型O35E菌株、(C)O35E nsrR突變體和(D)O35E aniA突變體的側(cè)翼區(qū)域。箭頭表示用于PCR的不同引物的相對(duì)位置。

圖2通過(guò)qRTPCR測(cè)定卡他莫拉菌ETSU-9野生型和突變株在不同生長(zhǎng)條件下aniA的表達(dá)。從野生型ETSU-9(wt)和ETSU-9 nsrR突變體(nsrR)細(xì)胞中分離出總RNA，這些細(xì)胞在含30μM Desferal(DF30)的肉湯和連續(xù)流生物膜系統(tǒng)(BF)中生長(zhǎng)，在鐵限制條件下處于浮游狀態(tài)(PT)。qRTPCR如“材料與方法”中所述進(jìn)行。

圖3、NsrR對(duì)野生型、突變型和互補(bǔ)突變型卡他莫拉菌AniA蛋白表達(dá)的影響。用多克隆AniA抗血清(A)或CopB特異性單克隆抗體10F3(B)作為一抗，對(duì)菌株的全細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western印跡分析。泳道1，野生型菌株O35E；泳道2，O35E nsrR突變體；泳道3，O35E aniA突變體；泳道4，O35E nsrR(pWW115)；泳道5，O35E nsrR(pWW150)；第6道，野生型ETSU-9；第7道，ETSU-9 nsrR突變體；第8道，ETSU-9 aniA突變體；第9道，ETSU-9 nsrR(pWW115)；第10道，ETSU-9 nsrR(pWW150)。推測(cè)的AniA單體和二聚體的位置用A組右側(cè)的箭頭表示。CopB外膜蛋白被用作載荷對(duì)照，其位置在B組右側(cè)用箭頭表示。分子質(zhì)量標(biāo)記物的位置在各圖的左側(cè)。

圖4、NO2-對(duì)卡他莫拉菌野生型、突變型和互補(bǔ)突變株生長(zhǎng)的影響。野生型菌株O35E(A)、O35E aniA突變體(B)、O35E nsrR突變體(C)、O35E nsrR aniA突變體(D)、O35E nsrR(pWW115)(E)和O35E nsrR(pWW150)(F)的細(xì)胞在BHI培養(yǎng)基(黑正方形)或含5mM NaNO2的BHI培養(yǎng)基(黑三角形)中生長(zhǎng)。大部分?jǐn)?shù)據(jù)為三個(gè)獨(dú)立生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的平均值；B組數(shù)據(jù)例外，為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。

圖5、確定受NsrR調(diào)控的卡他莫拉菌基因。(A)按照材料與方法中的描述，對(duì)從野生型菌株O35E、7169和ETSU-9以及這些菌株的nsrR突變體中分離的總RNA進(jìn)行了DNA微陣列分析。圖中顯示了在所有三個(gè)nsrR突變體中持續(xù)上調(diào)至少兩倍(P<0.002)的基因數(shù)據(jù)。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。(B)qRT-PCR分析norB、aniA、MC ORF 683和MC ORF 1550在菌株O35E的nsrR突變體和野生型細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平。qRT-PCR測(cè)量的內(nèi)源對(duì)照是MC ORF 1234的表達(dá)。最大和最小相對(duì)表達(dá)水平用誤差條表示。


結(jié)論與展望


卡他莫拉菌在生物膜中的生長(zhǎng)導(dǎo)致兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)aniA和norB的明顯上調(diào)，這兩個(gè)開(kāi)放閱讀框被預(yù)測(cè)為分別編碼亞硝酸鹽還原酶和一氧化氮還原酶。研究表明，位于aniA和norB之間的一個(gè)ORF被命名為nsrR，它編碼一個(gè)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。通過(guò)DNA微陣列分析和定量反轉(zhuǎn)錄酶PCR測(cè)定，nsrR失活導(dǎo)致三種不同的卡他莫拉菌菌株中aniA和norB的表達(dá)增加。在nsrR突變體中轉(zhuǎn)入野生型nsrR基因會(huì)導(dǎo)致AniA蛋白表達(dá)量減少。DNA微陣列分析表明，另外兩個(gè)ORFs(MC ORF 683和MC ORF 1550)在nsrR突變體中也持續(xù)上調(diào)。與野生型細(xì)胞相比，nsrR突變體細(xì)胞消耗亞硝酸鹽和一氧化氮的速度更快。然而，低濃度的亞硝酸鈉完全抑制了nsrR突變體的生長(zhǎng)。在nsrR突變體中引入aniA突變后，亞硝酸鹽對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用明顯逆轉(zhuǎn)，而野生型nsrR基因的反式存在則完全逆轉(zhuǎn)了這種抑制作用。NsrR對(duì)aniA表達(dá)的調(diào)控對(duì)亞硝酸鹽敏感，而NsrR對(duì)norB的調(diào)控對(duì)一氧化氮敏感。本研究提供了對(duì)卡他莫拉菌反硝化途徑及其調(diào)控機(jī)制的深入見(jiàn)解，并揭示了這些機(jī)制在細(xì)菌致病性中的潛在作用。unisense微電極技術(shù)在本研究的應(yīng)用對(duì)于理解卡他莫拉菌在生物膜狀態(tài)下的代謝途徑，以及NsrR調(diào)控蛋白如何影響這些代謝途徑至關(guān)重要。通過(guò)這些數(shù)據(jù)，研究人員能夠更深入地了解卡他莫拉菌如何在宿主中生存，以及它如何響應(yīng)和利用環(huán)境中的氮化合物。這對(duì)于揭示細(xì)菌的致病機(jī)制和開(kāi)發(fā)新的治療策略具有重要意義。