研究簡(jiǎn)介:富含黑素體的偏振上皮細(xì)胞的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)位于視網(wǎng)膜感光層和布魯赫膜之間，靠近脈絡(luò)膜。RPE損傷與退行性視網(wǎng)膜疾病的發(fā)展有關(guān)，例如糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)和年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)，這兩種疾病都是導(dǎo)致失明的主要原因。光感受器與RPE、布魯赫膜和脈絡(luò)膜的相互作用調(diào)節(jié)11-cis視網(wǎng)膜和光感受器外節(jié)(OS)的更新、神經(jīng)視網(wǎng)膜和循環(huán)之間的物質(zhì)交換，并形成外節(jié)血視網(wǎng)膜屏障（OBRB）。視桿細(xì)胞OS是一種參與視覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的修飾纖毛。特別是該操作系統(tǒng)包含大約2000個(gè)堆疊的膜盤，它們經(jīng)歷著受光調(diào)節(jié)的持續(xù)更新過程。當(dāng)RPE不斷吞噬OS尖端盤時(shí)，新的盤在纖毛基部形成。OS吞噬作用涉及αvβ5整合素受體、粘著斑激酶(FAK)和Mer酪氨酸激酶(MerTK)。椎間盤的形成仍不完全清楚，它涉及纖毛旁邊外翻形成囊的基底膜的合成，以及通過鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(IFT)摻入內(nèi)部節(jié)段合成的椎間盤蛋白。視桿細(xì)胞的凋亡比視錐細(xì)胞更容易受到損傷，進(jìn)而導(dǎo)致視錐細(xì)胞損失，損害高敏銳度視力。視桿細(xì)胞分泌一種營(yíng)養(yǎng)錐活力因子，這種因子是在截短的硫氧還蛋白樣蛋白中發(fā)現(xiàn)的。

為了闡明DR的發(fā)病機(jī)制，了解RPE和視桿OS之間的相互作用似乎至關(guān)重要，考慮到為了維持光轉(zhuǎn)導(dǎo)的能量需求，OS表現(xiàn)出自己的氧化代謝。由于還沒有研究調(diào)查這一主題，本研究工作旨在評(píng)估OS和RPE之間是否存在串?dāng)_，從而導(dǎo)致外視網(wǎng)膜累積氧化損傷。因此研究人員研究了未氧化（UOx）或氧化（Ox）rod OS吞噬作用對(duì)在正常（NG）或高葡萄糖（HG）條件下生長(zhǎng)的ARPE-19細(xì)胞的影響。

Unisense微呼吸系統(tǒng)的應(yīng)用

在37°C的密閉室中通過微呼吸氧電極（Unisense Microrespiration，Unisense A/S）評(píng)估耗氧率(OCR)。在實(shí)驗(yàn)中，將2×105 ARPE-19細(xì)胞重新懸浮在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，并用0.03 mg/mL毛地黃皂苷透化1分鐘?？偣蔡砑?0 mM丙酮酸加5 mM蘋果酸或20 mM琥珀酸，分別刺激由復(fù)合物I、III和IV或復(fù)合物II、III和IV組成的呼吸途徑。這兩種情況下，都添加了0.1 mM ADP。對(duì)于桿OS，使用50μg總蛋白，并使用0.1mM NADH和0.1mM ADP作為呼吸底物。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

數(shù)據(jù)表明RPE和OS光感受器之間存在串?dāng)_，這在DR發(fā)病機(jī)制中起決定性作用。這些數(shù)據(jù)還支持了新的發(fā)現(xiàn)，即DR的首要推動(dòng)因素是對(duì)視網(wǎng)膜外層神經(jīng)元的氧化損傷。后者反過來會(huì)對(duì)RPE造成氧化損傷，并最終對(duì)血管系統(tǒng)造成氧化損傷。數(shù)據(jù)還表明單獨(dú)的ARPE-19細(xì)胞可能并不是研究外視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激作用的詳盡模型。研究人員認(rèn)為評(píng)估幾種細(xì)胞類型之間的相互作用是必要的。目前的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢酝怀鲶w內(nèi)病理?xiàng)l件下可能發(fā)生的潛在現(xiàn)象，為未來DR的預(yù)防性干預(yù)開辟新的視野。然而有必要在動(dòng)物模型中進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)關(guān)于高血糖條件下RPE和rod OS之間氧化應(yīng)激產(chǎn)生中的串?dāng)_的體外數(shù)據(jù)。

圖1、生長(zhǎng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對(duì)ARPE-19細(xì)胞有氧代謝的影響：(A)耗氧率(OCR)；(B)有氧ATP合成；(C)P/O值作為OxPhos效率標(biāo)記。在存在丙酮酸加蘋果酸(P/M)或琥珀酸(Succ)的情況下評(píng)估了有氧代謝，以分別刺激復(fù)合物I、III和IV以及復(fù)合物II、III和IV的途徑?；疑碓?.6 mM葡萄糖（正常葡萄糖，對(duì)應(yīng)于通常用于生長(zhǎng)這些細(xì)胞的葡萄糖濃度）下生長(zhǎng)的ARPE-19細(xì)胞獲得的數(shù)據(jù)，白色柱代表在高葡萄糖培養(yǎng)基(25 mM)中生長(zhǎng)的相同樣品。

圖2、在正?；蚋咂咸烟桥囵B(yǎng)基中生長(zhǎng)的ARPE-19細(xì)胞中的脂質(zhì)過氧化和抗氧化防御：(A)丙二醛(MDA)濃度作為脂質(zhì)過氧化的標(biāo)記；(B)過氧化氫酶活性；(C)葡萄糖6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性；(D)谷胱甘肽還原酶(GR)活性；(E)谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性。所有測(cè)試的酶都參與細(xì)胞抗氧化防御。灰色柱代表在5.6 mM葡萄糖（正常葡萄糖，對(duì)應(yīng)于通常用于生長(zhǎng)這些細(xì)胞的葡萄糖濃度）下生長(zhǎng)的ARPE-19細(xì)胞獲得的數(shù)據(jù)，白色柱代表在高葡萄糖培養(yǎng)基(25 mM)中生長(zhǎng)的相同樣品。

圖3、ARPE-19細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的視紫紅質(zhì)數(shù)量作為細(xì)胞吞噬未氧化或氧化的視桿細(xì)胞能力的標(biāo)志。(A)與未氧化(UOx)或氧化(Ox)視桿OS孵育5.5小時(shí)后ARPE-19細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的視紫紅質(zhì)信號(hào)。補(bǔ)充圖S2報(bào)告了整個(gè)WB信號(hào)，包括分子量(MW)標(biāo)記。(B)視紫紅質(zhì)單體信號(hào)(39 kDa)的光密度分析。黑色柱代表孵育前rod OS懸浮液中視紫紅質(zhì)的濃度；灰色和白色柱分別代表NG和HG條件下的視紫紅質(zhì)濃度。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，代表四次獨(dú)立重復(fù)（n=4）。

圖4、ATP合成、耗氧率、氧磷效率和脂質(zhì)過氧化。圖所示的所有數(shù)據(jù)均已獲得從與呼吸底物(0.6 mM)預(yù)孵育或未孵育的牛棒狀OSs中提取NADH和20 mM琥珀酸鹽/或0.1 mM ADP，并在黑暗中維持(A)通過F1Fo-ATP合成ATP。合成酶和(B)耗氧量(OCR);在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中都是0.1 mM加入NADH誘導(dǎo)OCR和ATP合成。(C)P/O值，OxPhos效率的標(biāo)志，計(jì)算為合成ATP與消耗氧氣的比值。(D)MDA含量作為脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物。數(shù)據(jù)具有四個(gè)獨(dú)立重復(fù)的代表性(n=4)。

圖5、在正常或高葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并與UOx-或Ox-rod OS一起孵育的ARPE-19細(xì)胞中脂褐素的積累。(A)代表性共焦圖像，報(bào)告在正常葡萄糖(NG)和高葡萄糖(HG)條件下生長(zhǎng)并與UOx-或Ox-rod OS一起孵育的ARPE-19細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)脂褐質(zhì)積累（紅色信號(hào)）。藍(lán)色信號(hào)對(duì)應(yīng)于用DAPI染色的細(xì)胞核。條形刻度對(duì)應(yīng)于10μm。(B)脂褐質(zhì)熒光信號(hào)的強(qiáng)度?；疑碓贜G條件下生長(zhǎng)的ARPE-19細(xì)胞獲得的數(shù)據(jù)，白色柱代表在HG條件下生長(zhǎng)的相同樣品。

結(jié)論與展望

視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）功能障礙與多種以視網(wǎng)膜變性為特征的疾病有關(guān)，例如糖尿病性視網(wǎng)膜?。―R）。然而外層視網(wǎng)膜神經(jīng)元也參與損傷觸發(fā)。研究人員評(píng)估了RPE和光感受器之間在引發(fā)和維持RPE氧化損傷方面可能存在的串?dāng)_。使用ARPE-19細(xì)胞作為人類RPE模型，在正常（NG，5.6 mM）或高葡萄糖（HG，25 mM）和未氧化（UOx）或氧化（Ox）哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜桿外節(jié)中生長(zhǎng)。ARPE-19細(xì)胞在NG和HG環(huán)境中都能有效吞噬rod OS。然而在HG中，與未處理的細(xì)胞和UOx-rod-OS處理的細(xì)胞相比，用Ox-rod OS處理的ARPE-19細(xì)胞積累了MDA和脂褐素，并表現(xiàn)出LC3、GRP78和caspase 8表達(dá)的改變。數(shù)據(jù)表明早期氧化損傷可能源自光感受器，隨后延伸至RPE，這為視網(wǎng)膜變性僅取決于RPE氧化還原變化的觀點(diǎn)提供了新的視角。