研究簡介:土壤對大氣氫(H2)的氧化是形成大氣氧化還原狀態(tài)的關(guān)鍵生物地球化學(xué)過程。直到最近，這還被認(rèn)為是一個非生物過程，但現(xiàn)在人們認(rèn)識到，來自至少九個門的多種需氧細(xì)菌氧化大氣中的H2。土壤對大氣氫(H2)的氧化是形成大氣氧化還原狀態(tài)的關(guān)鍵生物地球化學(xué)過程1。直到最近，這還被認(rèn)為是一個非生物過程，但現(xiàn)在人們認(rèn)識到，來自至少九個門的多種需氧細(xì)菌氧化大氣中的H2[NiFe]氫化酶構(gòu)成膜結(jié)合H2氧化金屬酶家族，支持細(xì)菌在富含H2的環(huán)境中需氧和厭氧生長；然而，這些酶通常不能氧化大氣中的H2，因為它們對H2的親和力較低。這些氫化酶尚未被分離出來，它們?nèi)绾芜M(jìn)化為選擇性氧化H2、耐受O2暴露以及與電子傳遞鏈相互作用仍然未知。值得注意的是，負(fù)責(zé)大氣H2氧化的氫化酶是否具有固有的高親和力，或者它們的親和力是否通過它們與呼吸鏈的相互作用來調(diào)節(jié)存在爭議。

為了解決這些知識空白，研究人員研究了需氧細(xì)菌恥垢分枝桿菌中大氣H2氧化的結(jié)構(gòu)和機(jī)制基礎(chǔ)。該細(xì)菌擁有2種系統(tǒng)發(fā)育上不同的氫化酶——Huc（2a組）和Hhy（1h組）——均可將H2氧化至低于大氣壓的水平。直接從恥垢分枝桿菌中分離出Huc，并確定了其氧化大氣H2的結(jié)構(gòu)和生化基礎(chǔ)。

Unisense微呼吸系統(tǒng)的應(yīng)用

使用極化至+100mV持續(xù)1小時的Unisense 氫氣微電極以電流分析法測量純化的Huc的H2消耗。最初，用氣體飽和緩沖液（50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 8.0）中的已知H 2標(biāo)準(zhǔn)物（0%、1%和10%H 2(v/v)）校準(zhǔn)電極。該緩沖液的制備方法是，首先用100%氮氣將所有緩沖液鼓泡1小時，以除去任何痕量的氧氣，然后將100%H 2(v/v)鼓泡通過脫氧緩沖液10分鐘。在脫氣和再脫氣之前，所有緩沖液均含有最終濃度為200μM的電子受體（甲萘醌、NBT或芐基紫精）。對于每個讀數(shù)，1 ml 1%(8μM)H 2將含有電子受體的注入緩沖液添加到微呼吸測定室中，直至最終濃度為1％H 2。隨后將電極放入室中進(jìn)行平衡。平衡后（大約10分鐘），通過針將BSA(0.3 mg ml-1)和Huc（0.3 mg ml-1 BSA中的1–3 nM）添加到腔室中，以免破壞溶液中的氣體平衡。使用SensorTrace Suite v3.4.00測量H 2濃度的變化，并且測量從添加Huc直到完成H2消耗的H2消耗的線性速率。H2線性速率計算八個時間點內(nèi)約2.5μM H 2至0.0125μM H 2濃度之間的Huc消耗量。

實驗結(jié)果

為了利用空氣中存在的痕量H2，微量氣體清除細(xì)菌的[NiFe]氫化酶需要與在富含H 2的缺氧或缺氧條件下發(fā)揮作用的對應(yīng)物相比具有不同的特性。通過對來自需氧細(xì)菌恥垢分枝桿菌的Huc的生化和電化學(xué)表征，研究表明了所需的O 2不敏感性和對H 2高親和力的特性。是這種氫化酶固有的，而不是由于與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的其他過程耦合而產(chǎn)生的。通過確定Huc的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)、分子動力學(xué)模擬以及FTIR和EPR光譜，我們提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，證明活性位點至少部分排除O 2有助于酶的O 2不敏感性。我們的數(shù)據(jù)表明，Huc具有較大的電化學(xué)過電勢，使其能夠獨特地調(diào)節(jié)痕量H 2的氧化以及將產(chǎn)生的電子直接捐贈給呼吸輔助因子甲基萘醌。證明了Huc通過一種獨特且極不尋常的機(jī)制來獲取甲基萘醌。通過支架蛋白HucM，Huc復(fù)合物可以從膜中提取甲基萘醌并將其運(yùn)輸94?至酶的電子受體位點。

圖1、Huc是一種高親和力的O2不敏感氫化酶。a)用200μM甲萘醌作為電子受體，對含有Huc或不含酶的密封小瓶頂部空間的H2濃度進(jìn)行氣相色譜分析。Huc可以將低于大氣濃度（紫線）的H 2氧化至檢測限（綠線）。濃度，濃度。b)用200μM NBT作為電子受體，對含有Huc、大腸桿菌Hyd1或不含酶的小瓶進(jìn)行氣相色譜分析。c)Huc在不同O 2飽和百分比的緩沖液中氧化H2的Michaelis-Menten動力學(xué)。d)具有不同電子受體的緩沖液中Huc H2消耗的Michaelis-Menten動力學(xué)，脫氣但含有痕量O2。e)固定化Huc蛋白膜在100％H2氣氛中的循環(huán)伏安圖。f)用包含氬氣、N 2和指示水平的H2的氣體混合物沖洗頂部空間的固定化Huc蛋白膜的循環(huán)伏安圖。

圖2、a)Huc寡聚物的冷凍電鏡密度圖，顯示其四個葉，每個葉包含兩個HucSL二聚體，四個位于中心的HucM亞基充當(dāng)寡聚物的支架。b)由4個HucM亞基（殘基20至79）形成的中央四聚體的卡通表示，其中單個HucS 2 L 2葉顯示為上下文的表面模型。c)Huc低聚物的不對稱單元的卡通表示。d)復(fù)合冷凍電鏡密度圖，顯示Huc“體”區(qū)域，以及與細(xì)胞膜外圍相關(guān)的“莖”區(qū)域。e)HucM C末端區(qū)域（殘基80至189）的AlphaFold2模型的卡通表示，顯示它形成四聚體卷曲螺旋管。f)卡通圖，顯示根據(jù)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)重建的完整Huc復(fù)合物以及適合莖區(qū)域冷凍電鏡密度圖的HucM C末端AlphaFold模型。

圖3、a）環(huán)境空氣下Huc[NiFe]星團(tuán)的立體圖。b）三個HucS[3Fe-4S]簇的結(jié)構(gòu)。c)處于分離的氧化態(tài)（Huc-Air）和H 2還原態(tài)（Huc-H 2）的Huc的高溫（30K）EPR光譜。g=2.03處的各向同性信號（g是朗德因子）與氧化的[3Fe–4S]+簇有關(guān)，由于簇的還原，該信號在Huc-H 2中消失。在H2處理形式的Huc中沒有可辨別出歸因于還原的[4Fe–4S]+簇的信號。d）環(huán)境空氣中分離的氧化Huc的FTIR光譜，表明酶的[NiFe]活性位點采用與Ni-B狀態(tài)一致的氧化狀態(tài)。e）Huc[NiFe]活性位點，顯示Ni-B態(tài)羥基配體與簇中Ni和Fe離子之間的相對距離。f)HucSL二聚體，顯示了疏水性氣體通道的位置和寬度，該通道提供底物進(jìn)入[NiFe]活性位點。g)左圖，距離與時間的關(guān)系圖，顯示在H 2存在的情況下進(jìn)行HucSL分子動力學(xué)模擬過程中，H2與Huc[NiFe]活性位點之間的最近距離。h)與g類似，但顯示了在存在O2的情況下進(jìn)行的HucSL模擬中O2相對于Huc[NiFe]位點的位置。i，HucL D-His166與近端和內(nèi)側(cè)[3Fe-4S]簇的接近度以及未知配體的位置。

圖4、a)Huc低聚物的低分辨率冷凍電鏡重建中與Huc結(jié)合的甲基萘醌對應(yīng)的密度。b)對應(yīng)于Huc二聚體高分辨率冷凍電鏡圖中結(jié)合甲基萘醌的密度。由于掩蔽和對稱性平均，這些圖中沒有甲基萘醌尾部的密度。c)在遠(yuǎn)端[3Fe-4S]簇的電子轉(zhuǎn)移距離內(nèi)，HucS亞基對甲基萘醌頭基的協(xié)調(diào)。d)在高分辨率Huc冷凍電鏡密度圖中觀察到HucS的Tyr229的兩種構(gòu)象。Tyr229在甲基萘醌存在時采用開放構(gòu)象（頂部），而在甲基萘醌結(jié)合時采用互斥的閉合構(gòu)象（底部）。e)對純化Huc中的Folch提取物進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析。基峰色譜圖（左）顯示在24.6分鐘處有一個實質(zhì)性峰，對應(yīng)于m/z=804.66455（右）處的離子，這與β-二氫甲基萘醌-9的銨加合物一致，m/z=804.66531（下）。f)中心腔體Huc的混合棒和靜電表面表示，表明腔體表面襯有疏水殘基。g）HucM四聚體的視圖，顯示了封閉Huc內(nèi)部疏水室頂部的脂質(zhì)密度的存在。HHucM C端管的自上而下視圖，顯示管的內(nèi)部排列有疏水殘基（左），并且可以容納甲基萘醌分子（右）。i0Huc還原甲基萘醌的模型，使用大氣H2氧化產(chǎn)生的電子。

結(jié)論與展望

本研究工作提供了一種通過選擇最佳基質(zhì)剛度來精細(xì)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的創(chuàng)新方法。多種需氧細(xì)菌利用大氣中的H2作為生長和生存的能源。這一具有全球意義的過程可調(diào)節(jié)大氣成分、增強(qiáng)土壤生物多樣性并推動極端環(huán)境下的初級生產(chǎn)。大氣H2氧化歸因于[NiFe]氫化酶超家族的未表征成員。然而這些酶如何克服在環(huán)境水平的催化毒物O2中氧化皮摩爾水平的H2的非凡催化挑戰(zhàn)以及衍生的電子如何轉(zhuǎn)移到呼吸鏈仍然懸而未決。在這里研究人員確定了恥垢分枝桿菌氫化酶Huc的冷凍電子顯微鏡結(jié)構(gòu)Huc是一種高效的氧不敏感酶，可將大氣中H2的氧化與呼吸電子載體甲基萘醌的氫化結(jié)合起來。Huc使用狹窄的疏水性氣體通道以犧牲O2為代價選擇性地結(jié)合大氣中的H2，并且3個[3Fe–4S]簇調(diào)節(jié)酶的特性，從而使大氣中的H2氧化在能量上是可行的。Huc催化亞基在膜相關(guān)莖周圍形成八聚體833 kDa復(fù)合物，從膜上轉(zhuǎn)運(yùn)并還原甲基萘醌94?。這些發(fā)現(xiàn)為大氣H2氧化的生物地球化學(xué)和生態(tài)學(xué)重要過程提供了機(jī)制基礎(chǔ)，揭示了依賴于長程醌傳輸?shù)哪芰狂詈夏Ｊ?，并為開發(fā)氧化環(huán)境空氣中H 2的催化劑鋪平了道路。本研究的極大地擴(kuò)展了對減少呼吸醌的可能性的認(rèn)識。這些發(fā)現(xiàn)為生物催化劑的開發(fā)開辟了途徑，因為迄今為止在全細(xì)胞和純化酶系統(tǒng)中應(yīng)用的所有氫化酶都是被O2抑制的低親和力酶。Huc作為一種對氧不敏感的高親和力酶和第2族[NiFe]氫化酶，為開發(fā)在環(huán)境條件下運(yùn)行的生物催化劑提供了基礎(chǔ)。