研究簡(jiǎn)介:微生物附著在惰性表面和生物表面上，很容易形成生物膜這在醫(yī)療環(huán)境中尤其成問題，因?yàn)楦稍锏谋砻嫔锬た梢栽诙喾N表面上存活很長(zhǎng)一段時(shí)間。生物膜中的微生物群落對(duì)殺菌劑、抗生素和物理壓力不太敏感因此，干燥的表面生物膜可以在衛(wèi)生保健相關(guān)感染的傳播中發(fā)揮重要作用，而干燥的環(huán)境表面是病原體轉(zhuǎn)移的持續(xù)來(lái)源。銅和銅合金表面近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注，作為一種減少細(xì)菌附著和生物膜以及隨后在醫(yī)療機(jī)構(gòu)中病原微生物傳播的方法，從而有可能減輕醫(yī)院介導(dǎo)感染的發(fā)生。在干燥的銅表面上，細(xì)菌是通過接觸介導(dǎo)的殺滅過程被殺滅的銅從表面溶解并積累在金屬基質(zhì)和細(xì)菌細(xì)胞之間的水界面，導(dǎo)致嚴(yán)重的膜損傷和細(xì)胞質(zhì)中的銅離子過載?？紤]到銅銀合金是一種電化學(xué)活性表面，并且預(yù)期與其他銅合金表面有不同的行為，這種合金的抗菌效果可能會(huì)在這種干燥的情況下得到增強(qiáng)表面接觸是銅合金表面公認(rèn)的主要?dú)蛩?，殺傷率?duì)任何實(shí)際應(yīng)用都至關(guān)重要。此外有證據(jù)表明，在表面接觸建立后，殺滅過程立即啟動(dòng)，銅離子的暴露表面積和釋放速率容易影響接觸殺滅的總體速率。因此本研究的目的是確定銅銀合金涂層在更接近真實(shí)條件下的抗菌活性，例如，在允許細(xì)菌生物膜形成的干燥條件下。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

pH測(cè)量采用pH微電極(PH25，針尖直徑≈25μm,Unisense A/S)，pH值在pH 4~9之間呈線性變化，90%響應(yīng)時(shí)間<10 S。pH微電極與參比微電極(REF-100，端徑≈100μm;Unisense A/S)浸入瓊脂糖基質(zhì)，以確保與微電極的電接觸。pH微電極根據(jù)三個(gè)pH緩沖液(pH 4.01,7.00和10.01，在實(shí)驗(yàn)溫度下)的傳感器讀數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)，在校準(zhǔn)范圍內(nèi)與pH值線性響應(yīng)。pH微電極連接到萬(wàn)用表(Unisense a/S)，在PC運(yùn)行軟件(SensorTrace Suite;Unisense/S)。在操作過程中，微電極傳感器被安裝在一個(gè)pc接口的電動(dòng)微操作器(MM33-2,MC-232）上定位。將接種的凝膠基體放置在銅銀合金涂層或未涂層的AISI 316基板載體(25×75 mm)上，并將電極小心地放置在與金屬表面的安全距離(<100μm)處，速度越快越好。為了捕捉初始pH上升，傳感器被放置在靠近表面(<100μm)，0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖(超純LMP瓊脂糖，Invitrogen，美國(guó))沉積在傳感器和參考電極尖端的表面。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

研究了銅銀合金涂層在干燥和現(xiàn)實(shí)生活條件下對(duì)細(xì)菌污染的抗菌性能。使用美國(guó)環(huán)保局的測(cè)試方法作為消毒劑和持續(xù)減少細(xì)菌污染的效果，并通過CLSM直接可視化。該合金成功通過了EPA兩種測(cè)試方法的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，在接觸2小時(shí)后，還原百分比等于或大于99.9%，在24小時(shí)時(shí)間間隔內(nèi)，還原百分比大于99.9%。在銅銀合金涂層和非涂層表面接觸殺滅的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌8325對(duì)細(xì)菌生物膜的殺滅率高于銅綠假單胞菌PAO1。對(duì)銅銀合金涂層表面的pH測(cè)量和監(jiān)測(cè)顯示，當(dāng)金黃色葡萄球菌8325懸浮液存在于表面和瓊脂糖鹽基質(zhì)之間的界面時(shí)，20分鐘后pH值迅速增加，并在pH 9.0時(shí)達(dá)到平臺(tái)期。

圖1、銅綠假單胞菌PAO1活細(xì)胞和死細(xì)胞暴露于a-d)銅銀合金涂層和e-h)未涂層AISI 316表面在a開始時(shí)監(jiān)測(cè)，e)暴露后，b,f)10分鐘，c,g)25分鐘和d,h)60分鐘。箭頭表示金屬表面的位置。細(xì)胞用改良活/死染料染色混合物(0.2%SYTO 9綠色熒光核酸和0.2%SYTOX AADvanced死細(xì)胞染色)染色，活細(xì)胞呈綠色，死細(xì)胞呈紅色。

圖2、銅綠假單胞菌PAO1活細(xì)胞和死細(xì)胞暴露于a-d)銅銀合金涂層和e-h)未涂層AISI 316表面在a開始時(shí)監(jiān)測(cè)，e)暴露后，b,f)10分鐘，c,g)25分鐘和d,h)60分鐘。箭頭表示金屬表面的位置。細(xì)胞用改良活/死染料染色混合物(0.2%SYTO 9綠色熒光核酸和0.2%SYTOX AADvanced死細(xì)胞染色)染色，活細(xì)胞呈綠色，死細(xì)胞呈紅色。

圖3、金黃色葡萄球菌8325活細(xì)胞和死細(xì)胞的比例a)銅銀合金涂層和b)未涂層AISI 316表面和銅綠假單胞菌PAO1活細(xì)胞和死細(xì)胞暴露于c)銅銀合金涂層和d)未涂層AISI 316表面。

圖4、用0.15 m NaCl 0.5%瓊脂糖基質(zhì)加載金黃色葡萄球菌8325懸浮液對(duì)鍍銅銀合金和未涂覆SS316表面的pH值進(jìn)行監(jiān)測(cè)。*由于傳感器定位較慢，該復(fù)制用模型(在實(shí)驗(yàn)部分表明)進(jìn)行了擬合，該模型允許外推其初始pH上升。

圖5、在未加載0.15 m NaCl 0.5%瓊脂糖基質(zhì)下，銅銀合金涂層和未涂層SS316表面的pH監(jiān)測(cè)。

結(jié)論與展望

本研究設(shè)計(jì)了一種定制的共聚焦成像協(xié)議，可以實(shí)時(shí)可視化銅銀合金表面細(xì)菌生物膜的殺死過程，并監(jiān)測(cè)100分鐘的動(dòng)力學(xué)。銅銀合金涂層在5分鐘內(nèi)根除革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生物膜，而革蘭氏陰性細(xì)菌的生物膜則被殺死得更慢。原位pH監(jiān)測(cè)（unisense微電極剖面分析系統(tǒng)）表明，在金屬表面和細(xì)菌生物膜之間的界面增加了2 log單位;然而，當(dāng)在緩沖液中測(cè)試時(shí)，細(xì)菌的活力不受這個(gè)提高(pH 8.0-9.5)的直接影響。OH?的產(chǎn)生是電化學(xué)活性表面與細(xì)菌生物膜在環(huán)境條件下相互作用的結(jié)果，因此是銅銀合金涂層接觸介導(dǎo)殺滅的一個(gè)方面，而不是觀察到的抗菌效果的直接原因。細(xì)菌細(xì)胞的氧化、銅離子的釋放和局部pH值的提高共同決定了銅銀合金涂層干表面的抗菌活性。