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近幾十年來,新興的神經(jīng)刺激手段,如腦深部電刺激(DBS)、經(jīng)顱磁刺激(TMS)、經(jīng)顱直流電刺激(tDCS)等,已在臨床和實驗室研究中用于治療癲癇。其中,無創(chuàng)經(jīng)顱磁刺激治療癲癇的研究越來越受到國內(nèi)外研究者和臨床醫(yī)師的關(guān)注。研究表明,20~100Hz的電磁刺激(EMS)對持續(xù)部分性癲癇有積極的治療作用。影響癲癇的磁場刺激的另一個關(guān)鍵參數(shù)是磁刺激的持續(xù)時間(即刺激脈沖的數(shù)量)。研究表明,3000個脈沖的磁刺激減少了23%的癲癇發(fā)作,1500個脈沖減少了3%。雖然這些研究證明不同模式的磁刺激可以調(diào)節(jié)EFA過程,但其強度和時間依賴性的微觀效應無法實時記錄。
使用無鎂人工腦脊液(ACSF)建立的癲癇樣活動(EFA)模型已經(jīng)成為一種被廣泛接受的顳葉癲癇模型。近年來的研究表明,癲癇發(fā)作開始前存在從短暫的發(fā)作問期放電(IIDs)到延長的發(fā)作期放電(IDs)的過渡過程。然而,EMS是否會影響IIDs向IDs的轉(zhuǎn)變尚未被研究。
因此,為了進一步解決上述這類問題,天津工業(yè)大學 提出了基于多電極陣列記錄的實時電磁刺激對癲癇樣活動的調(diào)制作用及電磁刺激用于癲癇放電模型研究的可行性,并進一步確定了其對海馬的不同強度和時間效應。
(1)構(gòu)建大鼠癲癇模型
采用持續(xù)灌流低水平鎂離子(Mg2+被從正常人工腦脊液中移除,其他離子濃度不變)的人工腦脊液ACSF來誘發(fā)癲癇樣放電活動,這種方式構(gòu)成的顳葉癲癇實驗模型現(xiàn)在被廣泛接受。實驗前1h,對大鼠進行稱重和深度麻醉。將大鼠迅速斷頭置于4℃的冰枕中,并置于準備好的0℃ACSF中3分鐘,以確保大腦處于低代謝水平。ACSF提前10min注入95%O2/5%CO2。將左腦和右腦分別放在4℃的冰枕上,然后將它們放回0℃的ACSF中。取出左(或右)腦區(qū),放入模具中,用冰夾夾住。用配置好的36℃液體瓊脂將腦切片固定在模具中。將模具固定在振動組織切片機上進行切片。選取海馬CA1、CA3和DG區(qū)完整的腦片,轉(zhuǎn)移到孵育槽中,在32℃含95%O2/5%CO2的ACSF中孵育至少2h。
(2)微電極陣列(MEA)記錄誘發(fā)的癲癇樣活動EFA
多電極陣列電生理記錄系統(tǒng)主要由MEA主機、灌注系統(tǒng)和溫度控制器組成。實驗過程中,將孵育的海馬腦片從孵育槽快速轉(zhuǎn)移到玻璃電極上,然后將玻璃電極放入MEA2100-60中。合理調(diào)整海馬腦片位置,確定每個海馬腦片區(qū)域?qū)Aщ姌O的64個記錄點。灌注系統(tǒng)使用前10min持續(xù)向ACSF注入95%O2/5%CO2的混合液,以保證腦片的活性和正常代謝能力。同時打開溫控器,確保MEA2100記錄平臺和灌注液的溫度保持在37℃。
(3)實時EMS的實驗設置與應用
用于產(chǎn)生磁場的線圈由銅線制成,纏繞在有機玻璃框架上。磁刺激線圈驅(qū)動器由數(shù)據(jù)采集卡和自制功率放大器組成。輸入波形為內(nèi)間隔10ms的脈沖信號,刺激脈寬也為10ms。逆時針設置磁圈電流,將腦片置于磁圈上方約7mm處。在一段時間內(nèi)記錄到穩(wěn)定的EFA事件后,添加高、低峰對峰輸入電壓的100hz EMS(設定不同持續(xù)時間)。
(4)數(shù)據(jù)分析及處理
無鎂ACSF灌注10~15min后,電極陣列系統(tǒng)可記錄到海馬CA1、CA3和DG區(qū)錐體細胞層異常同步癲癇樣放電,并逐漸進入穩(wěn)態(tài)。每個EFA都涉及從IIDs到IDs的轉(zhuǎn)換。記錄過程中,海馬腦片自發(fā)放電信號峰值超過背景標準差4倍,連續(xù)放電時間超過300ms的事件被識別為EFA。將連續(xù)放電時間<300ms的癲癇事件定義為IIDs(交互放電),連續(xù)放電時間>2000ms的癲癇事件定義為IDs(工業(yè)放電)。采用MEA配套分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理。實驗收集的數(shù)據(jù)通過數(shù)字導出,使用MATLAB和Origin 9.0軟件進行處理和統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析確定試驗組間差異,組間多重比較采用Tukey′s post-hoc檢驗進行校正。
(5)不同模式對癲癇放電活動的調(diào)控作用
記錄穩(wěn)定的EFA事件一段時間后,加入低峰值和高峰值輸入磁場強度的實時脈沖磁刺激,低強度實時磁場干預5分鐘可降低IDs的幅度,IDs事件仍然存在,而高輸入電壓實時磁場干預5分鐘可降低IDs的頻率和幅度,IDs事件已被完全抑制,短時高、低輸入強度磁場對EFA無影響,實時磁場可以阻斷從IIDs到IDs的正常EFA過程,即一個完整的EFA循環(huán),這種抑制效果與輸入強度和干預時間有關(guān)。此研究進一步提出了磁刺激作為抗癲癇替代療法的可能性。