神經(jīng)退行性疾病與神經(jīng)死亡密切相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致軸突束退化，導(dǎo)致神經(jīng)功能喪失。細(xì)胞治療方法的最新發(fā)展為增強(qiáng)神經(jīng)修復(fù)功效提供了潛在的可能性。神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）具有獨(dú)特的自我更新和多向分化能力，NSC分化為神經(jīng)元的效率至關(guān)重要，這與實(shí)現(xiàn)其在神經(jīng)退行性疾病治療中的臨床應(yīng)用相關(guān)。

另外，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NF)作為調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)病理的潛在治療因子受到了極大的關(guān)注。電刺激(ES)也被認(rèn)為是神經(jīng)損傷的有效治療方法。為了調(diào)節(jié)NSC分化的命運(yùn)決定，微流控平臺(tái)已廣泛用于創(chuàng)建體外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。最近的研究在微流控芯片上開發(fā)了皮質(zhì)紋狀體網(wǎng)絡(luò)，從而實(shí)現(xiàn)了軸突生長(zhǎng)的突觸連接。微流體裝置的設(shè)計(jì)目的是分離突觸前和突觸后區(qū)室，這可以允許進(jìn)入和操縱皮質(zhì)軸突和紋狀體樹突之間的形成。此外，基于多微陣列電極（MEA）的生物電子平臺(tái)允許調(diào)制神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)和電生理學(xué)表征。微陣列電極的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠監(jiān)測(cè)神經(jīng)活動(dòng)的發(fā)育活動(dòng)和動(dòng)態(tài)響應(yīng)。最近，多項(xiàng)研究成功證明了MEA與微流控芯片的集成，可以對(duì)結(jié)構(gòu)化和可視化的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。因此，為了更好地觀察NSC的軸突再生和神經(jīng)分化，這將是一個(gè)很好的研究方向。

這項(xiàng)研究開發(fā)了一種集成微陣列電極的微流控芯片，作為軸突損傷和再生的體外中樞神經(jīng)系統(tǒng)模型。此外，這項(xiàng)研究中試圖探索微流體陣列電極系統(tǒng)中神經(jīng)突生長(zhǎng)與NF和ES協(xié)同效應(yīng)之間的關(guān)系。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，小鼠NSC被用作神經(jīng)生長(zhǎng)的原代細(xì)胞模型，并在微流體陣列電極系統(tǒng)中在有和沒有NF的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。ES在25 mV下施加1小時(shí)。該芯片的設(shè)計(jì)能夠通過分隔的微通道控制神經(jīng)突的生長(zhǎng)和神經(jīng)細(xì)胞的分化。此外，還在微流控陣列電極芯片中證明了NF和ES對(duì)神經(jīng)分化的協(xié)同作用。因此，該芯片可能成為研究神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)再生的有用工具。

設(shè)計(jì)原理

微流控陣列電極芯片的制作

制造了基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的微流體裝置。微陣列電極（MEA）是通過電子束物理氣相沉積制造的。所生產(chǎn)的微流控陣列電極芯片通過注入入口用70％乙醇進(jìn)行滅菌，并在細(xì)胞接種前用磷酸鹽緩沖液體清洗。

電化學(xué)性能表征

使用雙電極電化學(xué)系統(tǒng)對(duì)微流控陣列電極芯片的電化學(xué)性能進(jìn)行了表征。通過將電極浸入神經(jīng)分化培養(yǎng)基中5天進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性測(cè)試來評(píng)估電極的穩(wěn)定性。使用電化學(xué)分析儀進(jìn)行循環(huán)伏安法（CV）和電化學(xué)阻抗譜（EIS）測(cè)量。

免疫細(xì)胞化學(xué)和成像分析

將微流控陣列電極芯片中培養(yǎng)并固定的細(xì)胞洗滌后，通過在DPBS中與3%牛血清白蛋白在室溫下孵育3小時(shí)，可減少非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合。隨后，在4°C下用一抗處理細(xì)胞與二抗孵育，并對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。使用倒置共焦激光掃描顯微鏡獲取染色樣品的熒光圖像。通過Image J軟件分析標(biāo)準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度和平均神經(jīng)突長(zhǎng)度。

數(shù)據(jù)介紹

微流控陣列電極芯片的設(shè)計(jì)

微流控芯片由兩個(gè)主通道組成：一個(gè)用于小鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)（左通道），一個(gè)用于衍生神經(jīng)干細(xì)胞軸突（右通道）。細(xì)胞培養(yǎng)通道和衍生通道通過橋通道相連。如圖1所示，微陣列電極由兩部分組成，左側(cè)是產(chǎn)生電活動(dòng)以分化神經(jīng)干細(xì)胞的ES電極，右側(cè)是應(yīng)用ES的軸突電極。此外，基于PDMS的微流控設(shè)備被仔細(xì)地排列在微陣列電極平臺(tái)的頂部，電極專門位于突觸前和突觸后隔室的下方。鉻/金電極是通過在5 nm厚的Cr粘附層上沉積50 nm厚的金制成的。突觸前電極(直徑30μm)位于軸突微通道左側(cè)以刺激軸突起始段產(chǎn)生動(dòng)作電位(AP)，突觸后電極(直徑50μm)位于軸突微通道右側(cè)。MEA的微電極排列在基質(zhì)中，可用于監(jiān)測(cè)神經(jīng)細(xì)胞的胞外電活動(dòng)。這種帶有微陣列電極的微流控芯片既可以分離神經(jīng)室，也可以使用神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)重建大腦電路。

圖1微流控陣列電極芯片的實(shí)驗(yàn)裝置。

微電極的電化學(xué)分析

微流體陣列電極芯片中循環(huán)伏安法（CV）的電化學(xué)表征，證明了明顯氧化和還原峰的電極的明確電化學(xué)響應(yīng)（圖2A）。CV曲線表明，不帶NSC的介質(zhì)和帶NSC的介質(zhì)之間的陰極電荷存儲(chǔ)容量(CSC)不同。電極在不含和含有NSC的神經(jīng)分化培養(yǎng)基中5天的穩(wěn)定性結(jié)果如圖2B所示。計(jì)算出的CSC從沒有NSC的約45.3 F cm?2增加到有NSC的83.0 F cm?2。此外，具有NSC的介質(zhì)中的電極的EIS提供了隨時(shí)間變化的阻抗大小∣Z∣與頻率的關(guān)系曲線（圖2C）。在分化過程中，與對(duì)照組相比，在5天的時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)電極上形成的匯合細(xì)胞層。正如預(yù)期的那樣，電極的阻抗在100 Hz時(shí)以與時(shí)間相關(guān)的方式增加。這些參數(shù)可以提供定義電極失效點(diǎn)的信息，電極失效點(diǎn)是指電極芯片剝離表面上的材料。此外，微通道中的阻抗隨時(shí)間增加的原因是電極污垢的影響造成的，可以通過吸收而不是溶液產(chǎn)生。

圖2微陣列電極的電化學(xué)表征。

微流控陣列電極芯片中NSC衍生神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)突生長(zhǎng)

使用微流控陣列電極芯片上不同范圍（0-100 mV）的電參數(shù)刺激NSC，以優(yōu)化ES參數(shù)。與未刺激的NSC相比，在微流控芯片中用25 mV刺激NSC可增強(qiáng)其神經(jīng)突生長(zhǎng)。然后，檢查了是否可以在微流體陣列電極芯片中監(jiān)測(cè)和量化NF和ES治療的效果。如圖3A所示，證實(shí)NSCs在不同條件下5天后分化為具有長(zhǎng)神經(jīng)突的神經(jīng)細(xì)胞。此外，我們發(fā)現(xiàn)用NF和ES處理的NSC衍生神經(jīng)元顯示出比其他組顯著更長(zhǎng)的神經(jīng)突(p<0.01)(圖3B)。接下來，為了量化這些星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)標(biāo)記物的表達(dá)水平，我們使用Image J軟件對(duì)Tuj1或GFAP陽性部分進(jìn)行圖像分析（圖3C）。

圖3微流體陣列電極平臺(tái)中的軸突生長(zhǎng)。

軸突損傷和再生

為了再生醫(yī)學(xué)中未來潛在的治療應(yīng)用，測(cè)試了微系統(tǒng)是否可用于體外損傷后測(cè)定軸突再生。使用抽吸泵將軸突室的軸突取出，并通過單獨(dú)使用NF或NF和ES治療來使受損的軸突再生。有趣的是，損傷后3天，NF治療促進(jìn)了軸突再生，超出右通道邊界線（圖4A）。檢查了NF與ES治療一起在3天時(shí)對(duì)軸突再生的影響（圖4B）。形態(tài)學(xué)分析結(jié)果表明，軸突再生后，NF和ES治療組的平均神經(jīng)突長(zhǎng)度和平均神經(jīng)絲熒光強(qiáng)度顯著高于NF治療組（圖5）。NF+ES治療組神經(jīng)元的平均長(zhǎng)度為204.3±47.9μm，明顯長(zhǎng)于NF治療組（101.9±17.6μm；p<0.01）（圖5A）。此外，進(jìn)一步評(píng)估了成熟神經(jīng)元上的Tuj1和神經(jīng)絲免疫化學(xué)染色，以進(jìn)行軸突再生前后的比較。如圖5B和C所示，NF和NF+ES治療組軸突再生后Tuj1和神經(jīng)絲的表達(dá)水平（分別為56.3±13.0%、80.2±8.7%）增加。

圖4微流控陣列電極平臺(tái)中軸突損傷與再生。

圖5微流控陣列電極芯片中平均神經(jīng)突長(zhǎng)度分析。

總結(jié)

在這項(xiàng)研究中，微系統(tǒng)比傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)具有更靈敏地檢測(cè)治療效果，同時(shí)能夠定量檢測(cè)NSC分化和軸突生長(zhǎng)/再生。ES和NF的共刺激可以協(xié)同促進(jìn)軸突伸長(zhǎng)和NSC進(jìn)一步分化為神經(jīng)細(xì)胞。此外，NF和ES共刺激組比其他單一治療組或未治療組更能有效地抑制NSCs向星形細(xì)胞的分化。盡管需要進(jìn)一步的研究來更好地了解基于細(xì)胞的研究的潛在益處和局限性，但我們的微電極芯片為藥物篩選提供了強(qiáng)大的NSC培養(yǎng)平臺(tái)，通過處理NF和ES治療來促進(jìn)神經(jīng)分化和軸突再生。

Comments

1.這項(xiàng)研究提供了陣列電極更多應(yīng)用，為再生醫(yī)學(xué)提供了未來潛在的應(yīng)用。

2.在電化學(xué)應(yīng)用中電壓較小，不需要考慮電極絕緣避免緩沖液電解的問題，但長(zhǎng)時(shí)間使用仍然會(huì)污染電極。

3.這項(xiàng)研究的前處理過程過于繁瑣。