用于刺激視網(wǎng)膜神經(jīng)元的電子視網(wǎng)膜假體有望恢復(fù)視力。然而，傳統(tǒng)視網(wǎng)膜植入物的剛性電極會(huì)對(duì)軟視網(wǎng)膜組織造成損害。由于它們與退行性視網(wǎng)膜中的靶細(xì)胞的接近程度較差，因此它們的選擇性也有限。

近日，延世大學(xué)材料科學(xué)與工程系的Jang-Ung Park教授，眼科的Suk Ho Byeon教授以及釜山國(guó)立大學(xué)有機(jī)材料科學(xué)與工程系的Seung Geol Lee教授報(bào)道了一種柔性人造視網(wǎng)膜，具有直接打印的3D LM微電極，能夠進(jìn)行微創(chuàng)視網(wǎng)膜刺激。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，可見光照明誘導(dǎo)了光線入射的局部視網(wǎng)膜區(qū)域的RGCs的尖峰活動(dòng)，表明活rd1小鼠具有視力恢復(fù)的潛力。這些結(jié)果對(duì)不均勻視網(wǎng)膜變性患者的個(gè)性化人工視網(wǎng)膜的開發(fā)具有預(yù)后意義。其主要研究方向?yàn)橐噪娀瘜W(xué)為基礎(chǔ)的柔性可穿戴仿生器件的制備及應(yīng)用。

相關(guān)工作以“Liquid-metal-based three-dimensional microelectrode arrays integrated with implantable ultrathin retinal prosthesis for vision restoration”為題發(fā)表在Nature Nanotechnology上。

基本內(nèi)容

視網(wǎng)膜變形疾病通常會(huì)造成感光細(xì)胞逐漸喪失或者永久性損傷，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損害。然而，視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元能夠得以保留，該組織的電激活能夠產(chǎn)生視覺感知（光幻視），這使得制備利用光響應(yīng)裝置電刺激內(nèi)層視網(wǎng)膜神經(jīng)元的電子視網(wǎng)膜假體成為一種有前景的恢復(fù)視力的方法。值得注意的是，人類受試者及相關(guān)手術(shù)表明視網(wǎng)膜和植入物之間的不一致（例如電極與細(xì)胞之間的距離，細(xì)胞與設(shè)備之間的機(jī)械適配）是限制該設(shè)備成效和應(yīng)用的主要原因。為了解決這一限制，人們研究了超薄柔性光電器件以將其共形地附著在彎曲的視網(wǎng)膜表面上，但扁平形狀的電極會(huì)導(dǎo)致局部凹凸不平的視網(wǎng)膜表面產(chǎn)生幾何間隙。三維（3D）微電極有望有效刺激神經(jīng)系統(tǒng)，縮短電極與細(xì)胞之間的距離。此外，它們可以通過(guò)繞過(guò)不應(yīng)被刺激的神經(jīng)元來(lái)刺激選擇性局部區(qū)域，從而提供出色的選擇性和高空間分辨率。但是，先前報(bào)道的3D神經(jīng)電極往往利用剛性固態(tài)材料，這可能或直接損害柔軟的視網(wǎng)膜或?qū)е乱暰W(wǎng)膜內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，該研究團(tuán)隊(duì)公布了一種軟人造視網(wǎng)膜，將柔性、超薄和光敏晶體管陣列與液態(tài)金屬（LMs）的軟3D刺激電極集成在一起，用于視力恢復(fù)。其中，低毒性軟共晶鎵銦合金（EGaln）液態(tài)金屬被3D打印為具有高分辨率的刺激電極，相對(duì)于以前使用的剛性柱狀/尖峰電極材料相比，最大限度地減少了視網(wǎng)膜的不良損傷。此外，局部涂覆在這些EGaln-LM電極尖端上的鉑（Pt）納米團(tuán)簇能夠有效地將電荷注入視網(wǎng)膜神經(jīng)元。機(jī)器學(xué)習(xí)應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間產(chǎn)生的輸出信號(hào)，以分析誘發(fā)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)（RGC）棘波。并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了可見光照射引起的信號(hào)放大在光入射局部區(qū)域的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中引起實(shí)時(shí)反應(yīng)，能夠使患有大量感光細(xì)胞變性的活視網(wǎng)膜變性（rd1）小鼠恢復(fù)視力，有望應(yīng)用于治療人類視網(wǎng)膜變性相關(guān)疾病并促進(jìn)視力修復(fù)。

圖1.采用3D LM微電極陣列的軟人工視網(wǎng)膜。

首先，作者介紹了3DLM微電極陣列軟人工視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和體內(nèi)外生物相容性。該微電極（圖1a）能夠緊鄰不均勻變性視網(wǎng)膜表面，LMs突出的柔軟柱狀探針直接刺激視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）。從該器件結(jié)構(gòu)的布局來(lái)看（圖1b），EGaln微柱陣列通過(guò)3D打印直接印刷在光電晶體管的漏電極表面上，柱子側(cè)壁被聚對(duì)二甲苯C層封裝，頂端電鍍了鉑納米團(tuán)簇（鉑黑PtB）增加了微電極的納米級(jí)粗糙度和它們的電化學(xué)表面積。光電晶體管用于產(chǎn)生光電流，增大漏極電流，并在漏極電壓的脈沖刺激下，通過(guò)微電極注入RGCs的電荷顯著增加，然后在RGCs內(nèi)誘發(fā)的動(dòng)作電位傳遞到視神經(jīng)，從而替代視覺信息。這種人造視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)將高分辨率晶體管陣列和3D LM微電極集成在一起，每個(gè)微電極尖端均具有PtB涂層，且這些涂層沒(méi)有改變EGlan本身的彈性模量（圖1c-1e）。為了確保該裝置的體內(nèi)/體外生物相容性，作者使用人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的活/死細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞生存能力的測(cè)試以及在植入活體rd1小鼠五周后相關(guān)免疫和神經(jīng)毒性的測(cè)試，結(jié)果表明該裝置滿足醫(yī)療器械的體外/體內(nèi)毒性標(biāo)準(zhǔn)（圖1f-1g）。

圖2.光電晶體管陣列的光電特性和三維LM微電極的電化學(xué)特性。

然后，作者表征了該軟性人工視網(wǎng)膜的光電及電化學(xué)特性。不同光強(qiáng)度照射下該設(shè)備顯示出典型的光敏場(chǎng)效應(yīng)晶體管行為（圖2a-2b），并且具有較快的光響應(yīng)和恢復(fù)時(shí)間（圖2c）。此外，該晶體管陣列與入射光強(qiáng)度呈現(xiàn)線性比例（圖2d）并且允許在光照期間觀察通過(guò)鷹形蔭罩圖案的光（圖2e）。為了得到一個(gè)柱狀3D LM微電極陣列作為刺激電極，作者使用具有高分辨率打印的3D直接打印系統(tǒng)（圖2f）。其中玻璃毛細(xì)管嘴的內(nèi)徑?jīng)Q定了EGaln柱的直徑，載物臺(tái)的縱向下降速度決定支柱的高度（圖2g-2i）。此外，循環(huán)伏安曲線表明了該器件的阻抗和電荷存儲(chǔ)容量不隨支柱的高度而顯著變化（圖2j-2k）。

圖3.使用WT和rd1小鼠視網(wǎng)膜的離體實(shí)驗(yàn)。

隨后，作者使用野生型（WT）和rd1小鼠的視網(wǎng)膜探究了該器件的體外電生理作用，包括光、電刺激和電極的影響。先是記錄了它們的視網(wǎng)膜在3D LM微電極上通過(guò)視覺或者電誘發(fā)時(shí)的反應(yīng)，每個(gè)記錄電極與每個(gè)刺激電極相鄰放置（圖3a-3b）。將來(lái)自WT和rd1小鼠的分離的視網(wǎng)膜放置在該設(shè)備上，3D LM微電極朝向視網(wǎng)膜的RGC側(cè)。通過(guò)在沒(méi)有設(shè)備操作的光照下記錄了它們的視覺誘發(fā)電位（VEPs），而電誘發(fā)電位（EEPs）在黑暗狀態(tài)下利用設(shè)備操作時(shí)進(jìn)行記錄。此外，由于小鼠是只有兩種視錐細(xì)胞類型的兩色哺乳動(dòng)物（對(duì)藍(lán)光和綠光敏感），因此視覺誘發(fā)使用470 nm的藍(lán)光。結(jié)果顯示光線沒(méi)有在rd1小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)引起視網(wǎng)膜反應(yīng)（圖3c）。而在電誘發(fā)實(shí)驗(yàn)中，兩種小鼠的視網(wǎng)膜均出現(xiàn)可比EEP量級(jí)的RGC尖峰，而且rd1小鼠比WT型放電活動(dòng)更早、增強(qiáng)更明顯（圖3d）。已知rd1小鼠視網(wǎng)膜的形態(tài)學(xué)變化，包括RGC大小和內(nèi)核層厚度的減少，會(huì)影響RGCs的功能特性，導(dǎo)致刺激閾值增加和潛伏期延長(zhǎng)。接著作者分別使用平面型電極和具有不同高度的3D LM微電極在不同強(qiáng)度的光照下對(duì)兩種視網(wǎng)膜進(jìn)行設(shè)備操作時(shí)誘發(fā)EEP（圖3e-3i），結(jié)果顯示在平面型電極上誘發(fā)的RGC荊波放電率和光強(qiáng)度成比例增加（圖3g）。與rd1情況相比，由于正常感光層的天然反應(yīng)，WT小鼠視網(wǎng)膜顯示出更高的放電率。而盡管柱狀微電極具有與高度無(wú)關(guān)的電化學(xué)特征，但柱狀結(jié)構(gòu)電極在電刺激過(guò)程中增加了RGCs的放電活動(dòng)（圖3j）。且當(dāng)高度超過(guò)90μm時(shí)射速再次下降。這可能是由于刺激尖端穿過(guò)目標(biāo)RGCs時(shí)誤將RGCs作為目標(biāo)造成的。

圖4.用無(wú)監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)的信號(hào)分類。

考慮到視網(wǎng)膜活動(dòng)的復(fù)雜性，作者利用無(wú)監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)進(jìn)行信號(hào)處理。根據(jù)信號(hào)的大小和形狀，給定的數(shù)據(jù)被分為不同的組（圖4a）。然后，進(jìn)行了K-均值聚類，將初步分類的信號(hào)作為輸入數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示視網(wǎng)膜尖峰數(shù)據(jù)被進(jìn)一步分類為具有不同潛在價(jià)值大小的四個(gè)聚類（圖4b）。通過(guò)無(wú)監(jiān)督的機(jī)器學(xué)習(xí)來(lái)分析這些分類的視網(wǎng)膜尖峰，以獲得具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均信號(hào)。此外，聚類1、2和3的同一聚類內(nèi)的信號(hào)顯示了相似的潛在值形式和時(shí)間持續(xù)時(shí)間（圖4c-e)。當(dāng)刺激RGC體細(xì)胞時(shí)，典型的細(xì)胞外記錄的尖峰反應(yīng)顯示膜電位迅速降低（去極化），隨后增加（復(fù)極），而RGC軸突顯示相反的尖峰反應(yīng)。3D LM微電極電刺激后立即記錄的分類RGC信號(hào)波形僅呈現(xiàn)亞毫秒去極化的軀體RGC反應(yīng)。這些結(jié)果表明了使用3D LM微電極選擇性刺激RGC體細(xì)胞的潛力。盡管軸突刺激無(wú)法消除，但這種對(duì)RGC體的選擇性刺激有可能減少軸突激活，從而導(dǎo)致更自然的視覺和更少的不規(guī)則感知。

圖5.使用活rd1小鼠進(jìn)行視力恢復(fù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

最后，作者將具有3D LM微電極的人造視網(wǎng)膜裝置植入體內(nèi)活的rd1小鼠（n=3）中，確認(rèn)感光層完全簡(jiǎn)并后進(jìn)行活體小鼠的體內(nèi)視力恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。適配后的結(jié)果顯示該裝置很好地附著在視網(wǎng)膜表面，沒(méi)有明顯的損傷或出血（圖5a）。而且，手術(shù)后獲得的橫截面光學(xué)相干斷層掃描圖像表明，3D LM微電極被視網(wǎng)膜組織共形包圍，而沒(méi)有塌陷（圖5b）。作者通過(guò)恒定光照下誘發(fā)尖峰的電位和發(fā)射速率的實(shí)時(shí)跡線以及在該光照期間對(duì)發(fā)射速率進(jìn)行了空間映射。通過(guò)與無(wú)光照明的情況相比證明了該設(shè)備在受刺激的視網(wǎng)膜區(qū)域具有良好的均勻性（圖5c-5e）。此外，作者還使用激光通過(guò)橢球形圖案的陰影掩膜選擇性地暴露局部區(qū)域以驗(yàn)證退行性視網(wǎng)膜反應(yīng)，結(jié)果顯示光照區(qū)域表現(xiàn)出相對(duì)較大的視網(wǎng)膜響應(yīng)（圖5f-5g）。值得注意的是，當(dāng)RGC軸突受到電刺激時(shí)，電刺激會(huì)發(fā)生逆向傳播，導(dǎo)致黑暗狀態(tài)下的錯(cuò)誤RGC反應(yīng)。最大發(fā)射率（即感受野）的空間分布與這種照明的橢圓形非常相似（圖5h）。而且分類RGC尖峰顯示了與離體結(jié)果相似的體細(xì)胞RGC反應(yīng)的典型波形。為了定量比較激光照射和激光非照射區(qū)域（即黑暗狀態(tài)）的視網(wǎng)膜反應(yīng)，每個(gè)記錄電極（像素）的位置被標(biāo)記為索引（圖5i）。然后，對(duì)全亮像素（指數(shù)1-9）和暗態(tài)像素（指數(shù)16-36）記錄的最大發(fā)射率進(jìn)行平均。完全暴露區(qū)域的RGC放射性比本底R(shí)GC放射性大約高四倍，充分證明了該器件在體內(nèi)應(yīng)用的潛力。

總結(jié)

作者報(bào)道了一種柔性人造視網(wǎng)膜，具有直接打印的3D LM微電極，能夠進(jìn)行微創(chuàng)視網(wǎng)膜刺激。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，可見光照明誘導(dǎo)了光線入射的局部視網(wǎng)膜區(qū)域的RGCs的尖峰活動(dòng)，表明活rd1小鼠具有視力恢復(fù)的潛力。這些結(jié)果對(duì)不均勻視網(wǎng)膜變性患者的個(gè)性化人工視網(wǎng)膜的開發(fā)具有預(yù)后意義。

作者還探究了設(shè)備尺寸的進(jìn)一步擴(kuò)大和像素?cái)?shù)量的增加使其能夠應(yīng)用于具有更大眼球和更厚視網(wǎng)膜的大型動(dòng)物模型。減小刺激電極尺寸對(duì)于實(shí)現(xiàn)高分辨率刺激至關(guān)重要。作者認(rèn)為，對(duì)納米級(jí)材料（例如，Pt納米團(tuán)簇）的進(jìn)一步研究，通過(guò)在電極表面增加納米級(jí)粗糙度來(lái)增強(qiáng)刺激效果，可能是一項(xiàng)在未來(lái)實(shí)現(xiàn)更有效視力恢復(fù)的具有重要潛力的工作。