由創(chuàng)傷、感染、腫瘤切除和骨科手術(shù)中的骨異常引起的臨界骨缺損在患者一生中無法自然愈合。盡管骨移植已在臨床中廣泛用于增強(qiáng)骨再生和修復(fù)，但由于新型生物材料的進(jìn)步，易于制造和廣泛使用，骨組織工程（BTE）在治療大骨缺損方面具有前景。由骨折和疾病引起的大骨缺損是一項(xiàng)重大的臨床挑戰(zhàn)，通常無法通過身體的修復(fù)機(jī)制自行愈合。一系列證據(jù)表明，缺氧導(dǎo)致骨缺損區(qū)域ROS過量產(chǎn)生，對延遲骨再生具有重大影響。研究表明，2%的氧氣減少會(huì)影響成骨過程中的礦化和堿性磷酸酶(ALP)活性。因此，缺氧會(huì)降低骨再生和修復(fù)的治療效果。缺氧除了直接降低細(xì)胞活性外，還有利于活性氧（ROS）等促炎介質(zhì)的增加。然而，短時(shí)間內(nèi)補(bǔ)充過量氧氣會(huì)導(dǎo)致高氧張力，影響成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的活性。因此合理恢復(fù)骨微環(huán)境的缺氧狀態(tài)對于促進(jìn)骨修復(fù)至關(guān)重要。在此，研究人員設(shè)計(jì)了ROS清除和響應(yīng)性長時(shí)間產(chǎn)氧水凝膠（CPP-L/GelMA）作為“骨微環(huán)境調(diào)節(jié)水凝膠”，以逆轉(zhuǎn)骨缺損區(qū)域的缺氧微環(huán)境。脂質(zhì)體(CCP-L)和GelMA水凝膠。

在缺氧條件下，CPP-L/GelMA可以釋放CAT，降解過氧化氫產(chǎn)生氧氣，并被多余的ROS觸發(fā)，持續(xù)釋放氧氣2周以上。CPP-L/GelMA水凝膠產(chǎn)生的長時(shí)間富氧微環(huán)境顯著增強(qiáng)血管生成和成骨，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞生成。最后，CPP-L/GelMA通過Nrf2-BMAL1-自噬途徑在小鼠顱骨缺損模型中表現(xiàn)出優(yōu)異的骨再生效果。因此，CPP-L/GelMA作為一種調(diào)節(jié)骨組織呼吸的骨微環(huán)境水凝膠，可以有效清除ROS并根據(jù)骨缺損區(qū)域的需求提供長時(shí)間的供氧，具有巨大的臨床治療潛力。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

將15 mL樣品管中儲存的200μL CPP-L溶液用去離子水稀釋至2 mL，然后放入無菌氧氣室（O2流量=5 L/min）充氧20 s。然后用氧微電極（OX-NP，Unisense）測量添加2 mL CPP-L溶液前后的水溶液（4 mL）中的氧濃度。Unisense氧氣微電極用來實(shí)時(shí)的檢測水溶液中的O 2濃度。與H 2 O 2(10 mM)共孵育后，在不同時(shí)間評估CPP-L/GelMA水凝膠(含100μL CPP-L和5%Gelma hygrogel)的催化能力，CPP-L和PFC PLGA/PPS作為對照。然后插入氧微電極（OX-NP，Unisense），實(shí)時(shí)測量溶液中的O2濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

開發(fā)了一種智能響應(yīng)釋氧水凝膠。CPP-L/GelMA水凝膠作為骨組織呼吸過程中的微環(huán)境調(diào)節(jié)劑，可以遞送CAT以酶水解骨缺損微環(huán)境中的ROS形成氧氣。同時(shí)，多余的ROS可以觸發(fā)水凝膠中載氧納米粒子表面的PPS發(fā)生親水性變化，釋放氧氣，從而進(jìn)一步提高環(huán)境要求的供氧量。富氧微環(huán)境的形成促進(jìn)新生血管的形成并抑制破骨細(xì)胞的形成。更重要的是，充足的供氧可以提高成骨細(xì)胞中BMAL1基因的表達(dá)，從而通過增強(qiáng)自噬進(jìn)一步促進(jìn)成骨分化，最后顯著促進(jìn)骨再生。

圖1、具有清除活性氧和延長產(chǎn)氧作用以增強(qiáng)骨修復(fù)的骨微環(huán)境調(diào)節(jié)水凝膠的示意圖。(A)將PFC負(fù)載到PLGA/PPS納米顆粒中形成PFC PLGA/PPS納米顆粒。采用脂質(zhì)體共負(fù)載PFC PLGA/PPS納米粒子和CAT構(gòu)建CPP-L，將其進(jìn)一步封裝在GelMA水凝膠中，最終構(gòu)建CPP-L/GelMA智能響應(yīng)釋氧水凝膠。（B）CPP-L/GelMA可以作為“骨微環(huán)境調(diào)節(jié)水凝膠”來逆轉(zhuǎn)骨缺損區(qū)域的缺氧微環(huán)境，促進(jìn)成骨。CPP-L/GelMA植入骨缺損部位后，通過酶水解釋放CAT，產(chǎn)生氧氣缺氧微環(huán)境引起的ROS的產(chǎn)生。此外多余的ROS會(huì)觸發(fā)PFC PLGA/PPS納米顆粒釋放氧氣，然后氧氣破裂脂質(zhì)體并分散到周圍環(huán)境中以進(jìn)一步供氧。ROS清除和氧氣產(chǎn)生通過BMAL1自噬途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞形成，并促進(jìn)新生血管形成，最終加速骨再生。

圖2、復(fù)合水凝膠的表征。(A)CPP-L/GelMA水凝膠清除ROS和智能供氧的示意圖。(B)GelMA水凝膠和CPP-L/GelMA水凝膠的代表性SEM圖像。(C)水凝膠的楊氏模量(n=3)。(D)CPP-L/GelMA水凝膠在不同條件下的降解(n=3)。(E)不同條件下CPP-L/GelMA水凝膠中CAT的釋放(n=3)。(F)CPP-L/GelMA水凝膠的氧氣釋放速率(n=3)。(G)不同條件下CPP-L/GelMA水凝膠的氧氣釋放率(n=3)。比例尺：B中GelMA和低放大倍數(shù)CPP-L/GelMA為20μm，B中CPP-L/GelMA高放大倍數(shù)為10μm。

圖3、CPP-L/GelMA水凝膠對體外成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的影響。(A)CPP-L/GelMA水凝膠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化同時(shí)抑制破骨細(xì)胞形成的示意圖。(B)用不同制劑處理的MC3T3-E1細(xì)胞中ROS熒光染色的代表性圖像。(C)ROS熒光染色的定量分析(n=3)。(D)不同處理下MC3T3-E1分化成骨細(xì)胞的Col I、OPN、RUNX2、NRF2、HO-1和β-肌動(dòng)蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡。(E-H)不同處理的MC3T3-E1分化成骨細(xì)胞中相對Col I(E)、RUNX2(F)、NRF2(G)和HO-1(H)的定量分析(n=3)。(I)不同處理下MC3T3-E1分化成骨細(xì)胞的ALP染色的代表性圖像。(J)不同處理下MC3T3-E1分化成骨細(xì)胞的茜素紅染色的代表性圖像。(K)茜素紅染色的定量結(jié)果(n=3)。(L)不同處理下RAW 246.7分化破骨細(xì)胞的TRAP染色的代表性圖像。(M)TRAP陽性細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)(n=3)。比例尺：B、I、J和L為100μm。

圖4、CPP-L/GelMA水凝膠可以緩解體內(nèi)骨缺損部位的缺氧并清除ROS。(A)治療監(jiān)測時(shí)間線示意圖。(B)體內(nèi)代表性圖像注射ROS Brite?700后不同時(shí)間點(diǎn)的成像系統(tǒng)。(C)ROS Brite?700的定量分析(n=6)。(D)注射Hypoxyprobe后4周時(shí)顱骨缺損區(qū)域的代表性熒光圖像。(E)Hypoxyprobe染色的定量分析(n=3)。(F)植入的CPP-L或CPP-L/GelMA中的相對殘余氧濃度。(G)8周不同治療后小鼠顱骨缺損區(qū)域NRF2的代表性免疫組織化學(xué)染色圖像（紅色箭頭指向成骨細(xì)胞所在的骨膜）。比例尺：C為200μm，F(xiàn)為50μm。

圖5、CPP-L/GelMA水凝膠通過上調(diào)BMAL1和自噬促進(jìn)體內(nèi)成骨。(A)8周時(shí)不同治療后小鼠顱骨缺損區(qū)域的BMAL1、LC3和Col I免疫組織化學(xué)染色的代表性圖像（紅色箭頭指向成骨細(xì)胞所在的骨膜）。(B)8周時(shí)不同治療后小鼠顱骨缺損區(qū)域的BMAL1、Beclin1和OPN免疫熒光染色的代表性圖像（黃色箭頭指向成骨細(xì)胞所在的骨膜）。(C-E)對不同治療后小鼠顱骨缺損區(qū)域的BMAL1(C)、Beclin1(D)和OPN(E)免疫熒光染色進(jìn)行定量分析(n=3)。(F)顱骨缺損區(qū)缺氧微環(huán)境中ROS清除和供氧通過激活BMAL1-自噬途徑促進(jìn)成骨再生的示意圖體內(nèi)。比例尺：A中的BMAL1和LC3為50μm，B中的OPN；A中的Col I為200μm；B中的BMAL1和beclin1為20μm。

結(jié)論與展望

由骨折和疾病引起的大骨缺損是一項(xiàng)重大的臨床挑戰(zhàn)，通常無法通過身體的修復(fù)機(jī)制自行愈合。一系列證據(jù)表明，缺氧導(dǎo)致骨缺損區(qū)域ROS過量產(chǎn)生，對延遲骨再生具有重大影響。然而，短時(shí)間內(nèi)補(bǔ)充過量氧氣會(huì)導(dǎo)致高氧張力，影響成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的活性。因此，合理恢復(fù)骨微環(huán)境的缺氧狀態(tài)對于促進(jìn)骨修復(fù)至關(guān)重要。更重要的是這些材料很難根據(jù)受損區(qū)域的缺氧程度來加快供氧速率。本研究人員根據(jù)骨缺損區(qū)域的需求，采用了具有ROS清除潛力和延長供氧潛力的復(fù)合水凝膠材料。本研究中，研究人員通過設(shè)計(jì)了ROS清除和響應(yīng)性長時(shí)間產(chǎn)氧水凝膠（CPP-L/GelMA）作為“骨微環(huán)境調(diào)節(jié)水凝膠”，以逆轉(zhuǎn)骨缺損區(qū)域的缺氧微環(huán)境。脂質(zhì)體(CCP-L)和GelMA水凝膠。在缺氧條件下，CPP-L/GelMA可以釋放CAT，降解過氧化氫產(chǎn)生氧氣，并被多余的ROS觸發(fā)，持續(xù)釋放氧氣2周以上。CPP-L/GelMA水凝膠產(chǎn)生的長時(shí)間富氧微環(huán)境顯著增強(qiáng)血管生成和成骨，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞生成。最后CPP-L/GelMA通過Nrf2-BMAL1-自噬途徑在小鼠顱骨缺損模型中表現(xiàn)出優(yōu)異的骨再生效果。因此，CPP-L/GelMA作為一種調(diào)節(jié)骨組織呼吸的骨微環(huán)境水凝膠，可以有效清除ROS并根據(jù)骨缺損區(qū)域的需求提供長時(shí)間的供氧，具有巨大的臨床治療潛力。因此，本實(shí)驗(yàn)的工程設(shè)計(jì)的新型供氧CPP-L/GelMA水凝膠有望為臨床臨界尺寸骨缺損提供新的有效治療策略。