為了便于鏡下觀察，基于細胞培養(yǎng)的嗅球神經(jīng)元是主要的實驗對象之一。目前對離體嗅球神經(jīng)元的電信號檢測主要是膜片鉗記錄技術。隨著微電子機械加工技術(MEMS)的發(fā)展，微電極陣列(microelectrode array，MEA)、光尋址電位傳感器(light addressable potentiometric sensor，LAPS)和場效應晶體管(field effect transistor，F(xiàn)ET)等微傳感技術在生物信號檢測中得到迅速發(fā)展和廣泛應用。曾經(jīng)將嗅球神經(jīng)元培養(yǎng)在LAPS芯片上觀察氣味對僧帽細胞有無響應，作為研究嗅覺受體神經(jīng)元對氣味響應的實驗對照。下面是操作步驟：

1.1器件準備

微電極陣列MEA的制作采用標準微電子制作工藝：5吋玻璃基底(厚度500μm)經(jīng)過標準清洗后在表面磁控濺射一層厚度100～500?的Cr或Ti-W薄膜作為中間層，然后再濺射厚度為2000～5000?的Au薄膜形成電極層;濺射完成后，沉積一層聚酰亞胺或光刻膠作為絕緣層，并通過反應離子刻蝕技術(reactive ionetching，RIE)刻蝕暴露出金電極陣列圖形。將器件固定在PCB座上，利用點焊技術將器件上的焊點與PCB板上的焊盤用金線連通。然后用生物相容性較好的環(huán)氧樹脂覆蓋焊絲，粘接測試腔，室溫固化，得到如圖1(a)所示的器件。

圖1器件。(a)封裝的器件;(b)電鍍鉑黑的MEA顯微照片

為了降低熱噪聲，提高細胞胞外信號檢測的信噪比，本實驗對MEA金電極表面電鍍鉑黑顆粒，以增加電極的表面積，降低電極阻抗。電鍍系統(tǒng)采用三電極系統(tǒng)與CHI660 C型電化學工作站，每個電極的電鍍時間約45 s。最后得到的MEA顯微如圖1(b)所示，電極直徑為30μm。

1.2細胞培養(yǎng)

嗅球細胞的培養(yǎng)與大多數(shù)神經(jīng)元培養(yǎng)方法相似。將新生SD乳鼠(1～3 d)剪取鼠頭，將其放入酒精中消毒1～2 min后，立即轉(zhuǎn)入盛有磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)的無菌培養(yǎng)皿中。剪開頭皮，撥開顱骨，暴露全腦。輕輕剝離兩側(cè)嗅球，放于另一無菌盛有PBS的培養(yǎng)皿中。輕輕剝?nèi)ケ荒?，然后將嗅球剪? mm3左右的組織塊，加入2 mL含10μg/L神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)的DMEM(Dulbecco＇s modified eagle＇s medium)培養(yǎng)液中進行吹打，制成細胞懸液，接種在MEA表面。24 h后全量換液，48 h后滴加5-氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)以抑制膠質(zhì)細胞的過度生長。每3 d換液一次。培養(yǎng)5～7 d后，可以將芯片取出進行觀察和測試。

1.3染色處理

為了更加清楚地觀察嗅球神經(jīng)元的形態(tài)和生長狀態(tài)，信號測試結(jié)束后對細胞進行染色處理。本實驗采用瑞士染色法，染液包括Ⅰ和Ⅱ兩組份，由堿性染料美藍和酸性染料伊紅分別配制而成。首先將細胞培養(yǎng)腔內(nèi)的神經(jīng)測試液吸干;然后滴加適量染液Ⅰ于培養(yǎng)腔內(nèi)，保證溶液浸沒細胞;1 min后將等量的染液Ⅱ滴加入培養(yǎng)腔，保證染液Ⅰ、Ⅱ均勻混合;大約5 min后用清水沖洗數(shù)遍;將培養(yǎng)腔內(nèi)溶液吸干，置于顯微鏡下觀察。

1.4信號采集與分析

利用多通道放大器(MEDl6，Multichannel systems，GmbH，德國)，本實驗可以實現(xiàn)16通道的同步記錄，采樣頻率為10 kHz。

為了評估嗅球細胞網(wǎng)絡傳感器的檢測能力，選用嗅球內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(glutamic acid，Glu)進行了實驗研究[19]，觀察了Glu作用前后不同通道嗅球神經(jīng)元的響應。Glu溶液由正常神經(jīng)測試液配制而成，最終濃度為200μM。

信號的統(tǒng)計分析圖和光柵圖均通過Matlab軟件完成。