將UCNPs與四甲基羅丹明(TAMRA)標(biāo)記的ATP適配體(cATP),組成熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)體系,以碲化鎘量子點(diǎn)(CdTe QDs)作為光電活性材料,共同修飾于微電極表面,構(gòu)建可近紅外激發(fā)的ATP光電化學(xué)微傳感器。該P(yáng)EC微傳感器已成功應(yīng)用于藥物誘導(dǎo)的炎癥小鼠模型中腦內(nèi)ATP的活體原位檢測(cè)。


FRET調(diào)控光電流信號(hào)的可行性


將光電材料和UCNPs組成的熒光探針依次修飾到微電極上,并測(cè)試了不同修飾電極的光電流響應(yīng)。由于CdTe QDs-MWCNTs在980 nm波長(zhǎng)處的吸收很弱,因此在980 nm的近紅外光的激發(fā)下,只有CdTe QDs-MWCNTs修飾微電極表現(xiàn)出微小的光電流信號(hào)(圖1曲線(xiàn)a)。當(dāng)CdTe QDs-MWCNTs和UCNPs共同修飾到微電極表面后,UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極在含有200μmol/L AA的aCSF中表現(xiàn)出最強(qiáng)的光電流信號(hào),為315.2 nA(圖1曲線(xiàn)b),說(shuō)明UCNPs的發(fā)光能夠有效激發(fā)CdTe QDs并產(chǎn)生光電流信號(hào)。修飾cDNA后,cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極的光電流略微減小,為285.3 nA(圖1曲線(xiàn)c),表明cDNA在電極表面的成功修飾。將TAMRA-cATP修飾到UCNPs后,由于TAMRA對(duì)UCNPs發(fā)光的猝滅作用,TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極的光電流顯著降低,為91.3 nA(圖1曲線(xiàn)d)。TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極與ATP(80 nmol/L)反應(yīng)后,光電流明顯增強(qiáng),為185.5 nA(圖1曲線(xiàn)e)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ATP與適配體之間的特異性結(jié)合能夠引起光電流信號(hào)的改變。

圖1不同修飾電極的光電流大?。?a)CdTe QDs-MWCNTs/微電極;(b)UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極;(c)cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極;(d)TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極;(e)TAMRA-cATP/cDNA/UCNPs/CdTe QDs-MWCNTs/微電極與ATP反應(yīng)后


傳感器對(duì)ATP的響應(yīng)研究

圖2(A)微傳感器與不同標(biāo)準(zhǔn)濃度ATP反應(yīng)后的光電流響應(yīng);(B)光電流大小與ATP濃度之間的線(xiàn)性關(guān)系


傳感器的選擇性研究


由于活體環(huán)境復(fù)雜,傳感器的選擇性對(duì)活體分析十分重要。因此,我們考察了活體生物環(huán)境中共存的一些結(jié)構(gòu)類(lèi)似物、陰陽(yáng)離子和氨基酸等物質(zhì)對(duì)微傳感器的影響。共存物質(zhì)對(duì)微傳感器的光電流信號(hào)基本沒(méi)有影響或者影響較小,當(dāng)加入ATP時(shí),光電流顯著增加,說(shuō)明該微傳感器對(duì)ATP具有很高的特異性。


LPS的注射量對(duì)ATP含量的影響


LPS是一種常見(jiàn)的內(nèi)毒素,可以誘導(dǎo)小鼠全身性炎癥,我們通過(guò)腹腔注射LPS建立小鼠全身性炎癥模型,并用制備的微電極活體原位檢測(cè)小鼠腦內(nèi)細(xì)胞間質(zhì)中ATP的水平變化。我們首先研究了不同LPS注射量對(duì)小鼠皮質(zhì)內(nèi)ATP水平的影響。腹腔分別注射3 mg/kg、5 mg/kg、7 mg/kg時(shí),光電流分別為35.1 nA、47.0 nA、59.1 nA。相比于對(duì)照組(0 mg/kg)光電流信號(hào)分別增加了95.0%、161.1%、228.3%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LPS誘導(dǎo)的炎癥會(huì)引起腦內(nèi)ATP水平的顯著升高,并且ATP水平會(huì)隨著LPS濃度的增加而進(jìn)一步升高,說(shuō)明大腦向胞外釋放ATP是應(yīng)對(duì)炎癥的方式之一。


2.8炎癥時(shí)間對(duì)ATP濃度的影響研究


我們將制備的微電極用于LPS誘導(dǎo)的全身炎癥小鼠模型中,活體原位檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)腦內(nèi)ATP的含量變化,研究了藥物誘導(dǎo)時(shí)間與腦內(nèi)細(xì)胞間質(zhì)中ATP水平變化的關(guān)系。在2~6 h內(nèi),光電流信號(hào)隨著LPS注射時(shí)間的增加而增大,在LPS注射6 h時(shí),光電流信號(hào)達(dá)到峰值(47.2 nA),之后(6~24 h內(nèi))基本保持不變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:LPS誘導(dǎo)的炎癥會(huì)引起腦內(nèi)ATP含量的增加,并且隨著藥物誘導(dǎo)時(shí)間的推移,ATP的釋放進(jìn)一步增加,在6 h后達(dá)到峰值,并且在24 h內(nèi)一直維持在高位,說(shuō)明炎癥持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。