蛋白質(zhì)分子是典型的兩性電解質(zhì)分子。它在大于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中解離成帶負(fù)電荷的陰離子，向電場(chǎng)的正極泳動(dòng)，在小于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中解離成帶正由荷的陽(yáng)離子，向電場(chǎng)的負(fù)極泳動(dòng)。這種泳動(dòng)只有在等于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中，即蛋白質(zhì)所帶的凈電荷為零時(shí)才能停止。如果在一個(gè)有pH梯度的環(huán)境中，對(duì)各種不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)混合樣品進(jìn)行電泳，則在電場(chǎng)作用下，不管這些蛋白質(zhì)分子的原始分布如何，各種蛋白質(zhì)分子將按照它們各自的等電點(diǎn)大小在pH梯度中相對(duì)應(yīng)的位置處進(jìn)行聚焦，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的電泳以后，不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)分子便分別聚焦于不同的位置。這種按等電點(diǎn)的大小，生物分子在pH梯度的某一相應(yīng)位置上進(jìn)行聚焦的行為就稱為“等電聚焦”。等電聚焦的特點(diǎn)就在于它利用了一種稱為兩性電解質(zhì)載體的物質(zhì)在電場(chǎng)中構(gòu)成連續(xù)的pH梯度，使蛋白質(zhì)或其他具有兩性電解質(zhì)性質(zhì)的樣品進(jìn)行聚焦，從而達(dá)到分離、測(cè)定和鑒定的目的。

兩性電解質(zhì)載體，實(shí)際上是許多異構(gòu)和同系物的混合物，它們是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之間。常用的進(jìn)口兩性電解質(zhì)為瑞典Pharmacia-LKB公司生產(chǎn)的Ampholine和Pharmalyte，價(jià)格昂貴。國(guó)產(chǎn)的有中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所和上海生化所生產(chǎn)的兩性電解質(zhì)，價(jià)格便宜，質(zhì)量尚佳。兩性電解質(zhì)在直流電場(chǎng)的作用下，能形成一個(gè)從正極到負(fù)極的pH值逐漸升高的平滑連續(xù)的pH梯度。若不同的pH值的兩性電解質(zhì)的含量與pI值的分布越均勻，則pH梯度的線性就越好。對(duì)Ampholine兩性電解質(zhì)的要求是緩沖能力強(qiáng)，有良好的導(dǎo)電性，分子量要小，不干擾被分析的樣品等。

在聚焦過(guò)程中和聚焦結(jié)束取消了外加電場(chǎng)后，如保持pH梯度的穩(wěn)定是極為重要的。為了防止擴(kuò)散，穩(wěn)定pH梯度，就必須加入一種抗對(duì)流和擴(kuò)散的支持介質(zhì)，最常用的這種支持介質(zhì)就是聚丙烯酰胺凝膠。當(dāng)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳時(shí)，凝膠柱內(nèi)即產(chǎn)生pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品電泳到凝膠柱內(nèi)某一部位，而此部位的pH值正好等于該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，該蛋白質(zhì)即聚焦形成一條區(qū)帶，只要測(cè)出此區(qū)帶所處部位的pH值，即為其等電點(diǎn)。電泳時(shí)間越長(zhǎng)，蛋白質(zhì)聚焦的區(qū)帶就越集中，越狹窄，因而提高了分辨率。這是等電聚焦的一大優(yōu)點(diǎn)，不像一般的其他電泳，電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則區(qū)帶擴(kuò)散。所以等電聚焦電泳法不僅可以測(cè)定等電點(diǎn)，而且能將不同等電點(diǎn)的混合的生物大分子進(jìn)行分離和鑒定。

早期的等電聚焦電泳是垂直管式的，其特點(diǎn)是體系是封閉的，不與空氣接觸，可防止樣品氧化。近年來(lái)，又發(fā)展了超薄層水平板式等電聚焦電泳。此法的優(yōu)點(diǎn)是加樣數(shù)量多，節(jié)省兩性電解質(zhì)，電泳后固定、染色、干燥都十分迅速簡(jiǎn)便，其最大優(yōu)點(diǎn)是防止了電極液的電滲作用而引起正負(fù)兩極pH梯度的漂變。

測(cè)定pH梯度的方法有四種：

1.將膠條切成小塊，用水浸泡后，用精密pH試紙或進(jìn)口的細(xì)長(zhǎng)pH復(fù)合電極測(cè)定pH值，然后作圖。

2.用表面pH微電極直接測(cè)定膠條各部分的pH值，然后作圖。

3.用一套已知不同的pI值的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定pH梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.將膠條于－70℃冰凍后切成1 mm的薄片，加入0.5 ml 0.01M KCl，用微電極測(cè)其pH。

試劑、試劑盒丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺兩性電解質(zhì)Ampholine過(guò)硫酸胺TEMED磷酸NaOH三氯乙酸

儀器、耗材電泳儀垂直管式園盤(pán)電泳槽一套注射器與針頭移液管小燒杯若干培養(yǎng)皿直尺小刀精密pH試紙和帶細(xì)長(zhǎng)復(fù)合pH電極的pH計(jì)塑料薄膜和橡皮筋

實(shí)驗(yàn)步驟

儀器和用具

1.電泳儀

2.垂直管式園盤(pán)電泳槽一套

3.注射器與針頭

4.移液管：10 ml、5 ml、2 ml、1 ml、0.1 ml

5.小燒杯若干

6.培養(yǎng)皿一套

7.直尺

8.小刀

9.精密pH試紙和帶細(xì)長(zhǎng)復(fù)合pH電極的pH計(jì)

10.塑料薄膜和橡皮筋

試劑

1.丙烯酰胺

2.甲叉雙丙烯酰胺

3.兩性電解質(zhì)Ampholine（40%，pH3.5~9.5）

4.過(guò)硫酸胺（催化劑）

5.TEMED（四甲基乙二胺）（加速劑）

6.磷酸

7.NaOH

8.三氯乙酸（TCA）

溶液配制

1.丙烯酰胺貯液（30%丙烯酰胺，交聯(lián)度2.6%）：，30 g丙烯酰胺和0.8 g甲叉雙丙烯酰胺溶于H2O，定容至100 ml，濾去不溶物后存于棕色瓶，4℃可保存數(shù)月。（全班公用）（另一配方為29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉雙丙烯酰胺溶于H2O，定容至100 ml，交聯(lián)度為3.0%）。

2.兩性電解質(zhì)Amphline（40%）的加入量為：50ml/ml膠液。

3.過(guò)硫酸胺：配成1 mg/ml的濃度，當(dāng)天配制，配100 ml全班公用。膠液中的加入量為0.5 mg/ml膠液。

4.TEMED：膠液中的加入量為1ul/ml膠液。

5.蛋白質(zhì)樣品：選用兩種等電點(diǎn)相差較大的蛋白質(zhì)，每根垂直管中每種蛋白質(zhì)的加樣量控制在<100ug。蛋白質(zhì)樣品配制成各為5 mg/ml的濃度。配2.5 ml全班公用。

6.固定液：10%的三氯乙酸，每組配50 ml。

7.陽(yáng)極電極液：0.1M H3PO4

3.4 ml濃磷酸（85%）加H2O至500 ml，每個(gè)電泳槽用500 ml。

8.陰極電極液：0.5M NaOH

2 g NaOH加H2O溶解至500 ml，每個(gè)電泳槽用500 ml。

操作步驟

1.配膠

過(guò)硫酸銨是膠聚合的催化劑，因此最后加入，加畢，立即搖勻，因膠很快就會(huì)聚合，必須立即裝管。通?；瘜W(xué)聚合的膠液，需在過(guò)硫酸銨加入前進(jìn)行減壓抽氣處理，本實(shí)驗(yàn)將此抽氣步驟省略并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.裝管

每個(gè)學(xué)生裝兩支管，每組裝四支。先用肥皂洗手，然后將圓盤(pán)電泳槽的玻璃管洗凈，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在試管架上，用移液管將配好的膠液移入管內(nèi)，（每根玻璃管的容量約為1.5~1.8 ml），液面加至距管口1 mm處，用注射器輕輕加入少許H2O，進(jìn)行水封，以消除彎月面使膠柱頂端平坦。膠管垂直聚合約30分鐘，聚合完成時(shí)可觀察到水封下的折光面。

3.裝槽和電泳

用濾紙條吸去膠管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，將膠管垂直插入圓盤(pán)電泳槽內(nèi)，調(diào)節(jié)好各管的高度，記下管號(hào)。每支管約1/3在上槽，2/3在下槽。上槽加入500 ml 0.1M H3PO4，下槽加入500 ml 0.1M NaOH，淹沒(méi)各管口和電極，用注射器或滴管吸去管口的氣泡。上槽接正極，下槽接負(fù)極，開(kāi)啟電泳儀，恒壓160V，聚焦2至3小時(shí)，至電流近于零不再降低時(shí)，停止電泳。

4.剝膠

取下膠管，用H2O將膠管和兩端洗2次，用注射器沿管壁輕輕插入針頭，在轉(zhuǎn)動(dòng)膠管和內(nèi)插針頭的同時(shí)分別向膠管兩端注入H2O少許，膠條即自行滑出，若不滑出可用洗耳球輕輕擠出。膠條置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，記住正極端為"頭"，負(fù)極端為"尾"，若分不清時(shí)，可用pH試紙鑒定，酸性端為正，堿性端為負(fù)。

5.固定

取2支膠條置于一個(gè)小培養(yǎng)皿內(nèi)，倒入10%三氯乙酸溶液至沒(méi)過(guò)膠條，進(jìn)行固定，約半小時(shí)后，即可看到膠條內(nèi)蛋白質(zhì)的白色沉淀帶。固定完畢，倒出固定液，用直尺量出膠條長(zhǎng)度"L2"和正極端到蛋白質(zhì)白色沉淀帶中心（即聚焦部位）的長(zhǎng)度"L"。

固定后的膠條可在康強(qiáng)860紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)上用280nm或238nm波長(zhǎng)作凝膠掃描，然后用掃描圖作相應(yīng)的測(cè)量和計(jì)算。

6.測(cè)定pH梯度

將放在另一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)未固定的膠條，用直尺量出待測(cè)pH膠條的長(zhǎng)度"L1"。按照由正極至負(fù)極的順序，用鑷子和小刀依次將膠條切成10 mm長(zhǎng)的小段，分別置于小試管中，加入1 ml H2O，浸泡半小時(shí)以上或過(guò)夜，用仔細(xì)校正后的帶細(xì)長(zhǎng)pH復(fù)合電極的pH計(jì)測(cè)出每管浸出液的pH值。

數(shù)據(jù)處理

1.以膠條長(zhǎng)度（mm）為橫座標(biāo)，pH值為縱座標(biāo)作圖，得到一條pH梯度曲線。所測(cè)每管的pH值為10 mm膠條的pH的混合平均值。作圖時(shí)將此pH值取為10 mm小段中心即5 mm處的pH值。

2.用下式計(jì)算蛋白質(zhì)聚焦部位至膠條正極端的實(shí)際長(zhǎng)度L：

上式中：L'--量出蛋白質(zhì)的白色沉淀帶中心至膠條正極端的長(zhǎng)度。

L1--測(cè)pH的膠條的長(zhǎng)度

L2--固定后膠條的長(zhǎng)度

3.根據(jù)計(jì)算出的L，由pH梯度曲線上查出相應(yīng)的pH值，即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

4.畫(huà)出固定后所測(cè)膠條的示意圖。

收起

注意事項(xiàng)

附注

1.對(duì)兩性電解質(zhì)的要求

兩性電解質(zhì)是等電聚焦的關(guān)鍵試劑，所以對(duì)兩性電解質(zhì)的質(zhì)和量都要特別注意。兩性電解質(zhì)含量以2%～3%較適合，能形成好的pH梯度。由于載體兩性電解質(zhì)是由多乙烯多胺與丙烯酸進(jìn)行加成反應(yīng)生成的混合物，防止時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)分菌，分解變質(zhì)，不能使用。

2.指教注意的問(wèn)題

（1）丙烯酰胺最好是重結(jié)晶的。

（2）過(guò)硫酸銨一定要新配制。

（3）所有水要用雙蒸水。

（4）制膠時(shí)，玻璃板和模板必須水平放置。

（5）模板要平直光滑，不然灌膠時(shí)易濺漏。

3、防止燒膠

（1）平板等點(diǎn)聚焦電泳的膠很?。?.6 mm），當(dāng)問(wèn)柳在8mA時(shí)，電壓可上升到550V以上，由于陰極飄移，造成局部電流過(guò)大，膠承受不了而被燒斷。

（2）防止燒膠的辦法：注意觀察，穩(wěn)流8mA，電壓上升到550V時(shí)，立即關(guān)電源。用恒功率電泳儀，控制輸出功率在指定范圍。在一定功率范圍內(nèi)，改進(jìn)冷卻條件，使因電流產(chǎn)生的熱量及時(shí)散去。

（3）如果膠被燒了，可在燒斷的位置換上一條寬的電極條壓過(guò)斷縫或在電源電極條內(nèi)側(cè)加一電極條，以此補(bǔ)救。

4.攪拌制作注意事項(xiàng)

固定液可使蛋白質(zhì)變性，不再擴(kuò)散，故一定要多換一次；在電泳后取膠、固定、染色直至制干膠板都必須仔細(xì)，防止膠被損壞。