【摘要】：細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單元。分析單個細(xì)胞內(nèi)的基因、小分子和蛋白質(zhì)等，有助于了解細(xì)胞的新陳代謝、信號傳導(dǎo)等現(xiàn)象，對揭示生命活動規(guī)律及腫瘤疾病的早期診斷、預(yù)防和治療具有重要意義。因此，建立簡單、靈敏、快速檢測單細(xì)胞中基因、小分子等物質(zhì)的檢測成為生命分析領(lǐng)域重要的研究課題。目前用于單細(xì)胞分析的技術(shù)和方法有顯微分析及顯微操作技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光分析技術(shù)、光鑷技術(shù)、活細(xì)胞探針、數(shù)字成像技術(shù)及其相關(guān)聯(lián)用技術(shù)，并且發(fā)展迅速。

一些傳統(tǒng)的方法或存在取樣體積大、分析時(shí)間長及靈敏度低等缺點(diǎn)，難以適用于單細(xì)胞的分析，且獲取單個細(xì)胞中生物分子化學(xué)信息的檢測方法有限。電化學(xué)方法因其設(shè)備簡單，不需要使用探針對目標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，很大程度上減小了對細(xì)胞正常生理機(jī)能的擾動。同時(shí)，由于收集電化學(xué)信號無需受到光學(xué)衍射極限的限制，單細(xì)胞電化學(xué)分析方法不需要以時(shí)間分辨率為代價(jià)實(shí)現(xiàn)高空間分辨率。制備微電極能力以及納米電化學(xué)理論快速發(fā)展，顯著提高了電化學(xué)測量的檢測極限、特異性和分辨率。因此，電化學(xué)分析方法成為正在迅速發(fā)展的單細(xì)胞分析方法。本論文的研究目的是制備新型的金微電極電化學(xué)生物傳感器，建立對TP53基因的檢測及亞細(xì)胞水平上ATP的波動連續(xù)監(jiān)測的電化學(xué)新方法。主要研究內(nèi)容如下:1.TP53基因是重要的抑癌基因之一。TP53基因檢測方法對腫瘤疾病的早期診斷和預(yù)后具有重要意義。

本研究了基于金微電極檢測TP53基因的電化學(xué)傳感新方法。首先制備了尖端直徑分別為220 nm、120 nm、80 nm的3種金微電極，對微電極進(jìn)行了電化學(xué)方法的表征。后將3′端修飾巰基、5′端標(biāo)記有電活性物質(zhì)二茂鐵(Fc)的TP53基因捕獲探針通過巰基自組裝作用固定到金微電極表面，制備了可用于檢測目標(biāo)TP53基因的電化學(xué)傳感器。當(dāng)不存在目標(biāo)TP53基因時(shí)，F(xiàn)c遠(yuǎn)離電極表面，電流信號較小;當(dāng)檢測到目標(biāo)TP53基因時(shí)，電極上固定的單鏈TP53基因捕獲探針與目標(biāo)TP53基因雜交形成雙鏈DNA，F(xiàn)c靠近電極表面，電流信號增大。目標(biāo)TP53基因的檢出限為0.064 nmol/L。利用該傳感器對細(xì)胞提取液中的目標(biāo)TP53基因進(jìn)行了檢測，同時(shí)對人血清中目標(biāo)TP53基因進(jìn)行了加標(biāo)回收測定。

結(jié)果表明，所制備的電化學(xué)生物傳感器可用于目標(biāo)TP53基因的檢測。2.在亞細(xì)胞水平上監(jiān)測三磷酸腺苷(ATP)的變化對研究細(xì)胞能量代謝具有重要意義。然而，傳統(tǒng)的ATP檢測方法很難提供細(xì)胞不同區(qū)域ATP水平差異的信息。本研究建立了單細(xì)胞內(nèi)ATP分布和含量的實(shí)時(shí)分析方法。采用尖端直徑為120 nm的金微電極為工作電極，將二茂鐵(Fc)標(biāo)記的ATP適體自組裝到電極表面，制備成用于連續(xù)監(jiān)測亞細(xì)胞水平上ATP的波動的電化學(xué)傳感器。在目標(biāo)物質(zhì)ATP的存在下，ATP適體與兩個ATP結(jié)合形成適體-ATP復(fù)合物，單鏈適體DNA折疊形成G-四聚體框架結(jié)構(gòu)，F(xiàn)c與金微電極距離變小，F(xiàn)c的電子傳遞電流增大，基此對ATP進(jìn)行定量測定，檢出限為26μmol/L。并利用該電化學(xué)傳感器連續(xù)監(jiān)測了饑餓和Ca~(2+)誘導(dǎo)狀態(tài)下亞細(xì)胞水平ATP的波動變化。