微電極制備、表面修飾及活體／單細(xì)胞電分析應(yīng)用

趙旭 王克青 李博 李長(zhǎng)青 林雨青 （首都師范大學(xué)化學(xué)系北京１０００４８）

摘要

微電極是指至少在一維尺度上不大于２５μｍ的電極。微電極由于尺寸小而具有一些常規(guī)電極無(wú)法比擬的性質(zhì)，如具有電流密度高、響應(yīng)速度快、歐姆壓降（ｉＲ降）小、信噪比高等特點(diǎn)。微電極特殊的性質(zhì)使其在電化學(xué)測(cè)試中具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和重要性，并在分析化學(xué)、生物學(xué)及醫(yī)學(xué)等方面得到了廣泛應(yīng)用，尤其在生命分析領(lǐng)域如在單細(xì)胞檢測(cè)和活體分析中具有眾多重要的應(yīng)用。微電極的設(shè)計(jì)制備是微電極電化學(xué)發(fā)展應(yīng)用的關(guān)鍵，目前涌現(xiàn)出的制備微電極的技術(shù)有電化學(xué)刻蝕法、電沉積法、自組裝技術(shù)、化學(xué)鍍層技術(shù)等，這些制備方法為快速制備微電極提供了可能性。本文綜述了近年來(lái)微電極的研究進(jìn)展，包括微電極的特點(diǎn)、分類、制備方法及其單細(xì)胞檢測(cè)和活體分析方面的應(yīng)用，最后提出了微電極面臨的挑戰(zhàn)與發(fā)展方向。

１引言

在電化學(xué)的研究中常見(jiàn)的電極尺寸是毫米級(jí)別，由于其尺寸比較大，限制了其在一些領(lǐng)域的應(yīng)用。為了滿足小空間中如活體、細(xì)胞的電化學(xué)分析應(yīng)用需求，微電極應(yīng)運(yùn)而生。一般來(lái)說(shuō)，微電極是指至少在一維尺度上不大于２５μｍ的電極［１］，其尺寸小于擴(kuò)散層厚度。目前，微電極是電化學(xué)研究中興起較晚，也正蓬勃發(fā)展的一個(gè)領(lǐng)域。微電極有利于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)裝置的集成便攜化，同時(shí)能夠在介電常數(shù)較低的有機(jī)溶劑中檢測(cè)電化學(xué)活性物質(zhì)，近年來(lái)受到廣泛的關(guān)注［２］。微電極具有常規(guī)電極無(wú)法比擬的性質(zhì)，例如電流密度高［３］、響應(yīng)快速、ｉＲ降小、信噪比高、傳質(zhì)速度快、易達(dá)到穩(wěn)態(tài)等，這些優(yōu)勢(shì)使其在很多方面的快速、高靈敏檢測(cè)成為可能。從１９６０年開(kāi)始人們發(fā)現(xiàn)超微電極具有優(yōu)良的電化學(xué)特性。在神經(jīng)化學(xué)領(lǐng)域研究中，Ａｄａｍｓ和他的同事研究了一些生物胺類在微電極上的氧化過(guò)程及檢測(cè)方法［４］。在此基礎(chǔ)上，Ａｄａｍｓ［５］將碳糊電極植入到麻醉的鼠腦中，證明了傳統(tǒng)的伏安技術(shù)能夠成功應(yīng)用到生物組織分析，同樣證明神經(jīng)遞質(zhì)能夠從突觸間隙的空間擴(kuò)散到電極表面。與此同時(shí)，Ｗｉｇｈｔｍａｎ等［６］發(fā)現(xiàn)微電極在伏安技術(shù)方面具有比常規(guī)電極更為優(yōu)越的某些特性，展示了微電極在電化學(xué)及電分析化學(xué)領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景，從而引起了有關(guān)研究人員的廣泛興趣。目前，微電極的研究成為電化學(xué)的前沿領(lǐng)域，為研究者們探索物質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)、電化學(xué)性質(zhì)和電化學(xué)過(guò)程提供了一種強(qiáng)有力的手段，并在生命環(huán)境分析領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。制備微電極的方法多種多樣，有電沉積法［７］、電化學(xué)刻蝕法［８］、激光拉制法和內(nèi)部填充法等。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在制備微電極方法上涌現(xiàn)出很多新的技術(shù)，如自組裝技術(shù)［３］、化學(xué)氣相沉積、模板法、離子束刻蝕技術(shù)［３］、絲網(wǎng)印刷術(shù)［９］、紫外光照射化學(xué)鍍層技術(shù)［１０］等，這些制備方法為快速、高效制備微電極提供了新的思路。微電極在生命分析領(lǐng)域中的細(xì)胞檢測(cè)、活體生物原位分析等方面具有廣泛應(yīng)用［１１～１４］。在微電極表面進(jìn)行修飾之后可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)高選擇性和高靈敏檢測(cè)細(xì)胞和活體中神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)的含量以及體內(nèi)一些關(guān)鍵信號(hào)分子，如ＮＯ，ＣＯ等［１５］。微電極還可以應(yīng)用在毛細(xì)管電泳?電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)［１６］，作為掃描離子電導(dǎo)顯微鏡和掃描電化學(xué)顯微鏡的探針［１７，１８］，研究電化學(xué)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)［１９，２０］，環(huán)境分析中檢測(cè)水中重金屬離子［２１］，檢驗(yàn)食品新鮮程度［２２］和電位型活體細(xì)胞傳感等方面［２３～２６］?？傊?，微電極可以廣泛應(yīng)用于活體分析、生物傳感、生物細(xì)胞檢測(cè)、掃描探針顯微鏡領(lǐng)域、毛細(xì)管電泳?電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)、生命科學(xué)、食品學(xué)和環(huán)境分析與監(jiān)測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域。

基于微電極的高靈敏、高時(shí)空分辨檢測(cè)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的分析方法有助于追蹤神經(jīng)系統(tǒng)中活性物質(zhì)如能量代謝物質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物、ＮＯ等小分子動(dòng)態(tài)釋放，進(jìn)而有助于理解中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙或疾病產(chǎn)生的分子機(jī)制。根據(jù)微電極在生命分析領(lǐng)域中的重要意義，本文綜述了近年來(lái)微電極的研究進(jìn)展，包括微電極的特點(diǎn)、分類、制備方法以及在單細(xì)胞、活體等方面的最新應(yīng)用研究。

２微電極的特點(diǎn)

由于微電極的電極尺寸達(dá)到微米級(jí)，因此具有常規(guī)電極無(wú)法比擬的電極特性。

２.１電流密度高在一定電壓下，微電極能夠產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。半徑很小的電極以非線性擴(kuò)散中的徑向擴(kuò)散為主，由于電極尺寸小，所得擴(kuò)散電流在短時(shí)間內(nèi)即能達(dá)到穩(wěn)態(tài)［２７］。研究結(jié)果表明當(dāng)電流達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)，電流的密度與電極半徑成反比，因此，微電極具有很高的電流密度［７］。

２.２ｉＲ降小

在電解池中存在電極自身的電阻和電極表面附近溶液層的電阻，從而會(huì)產(chǎn)生ｉＲ降。而在微電極上產(chǎn)生的極化電流數(shù)量級(jí)一般在１０－９Ａ左右，甚至可達(dá)到１０－１２Ａ，因此ｉＲ降小。

２.３信噪比高

充電電流ｉｃ與時(shí)間ｔ的關(guān)系如下式表示：

ｉｃ＝ΔＥＲｅｘｐ（－ｔＲＣ）（１）

式中，ΔＥ為階躍電位的幅度，Ｒ為電解池內(nèi)阻，ｔ為階躍電位持續(xù)時(shí)間，Ｃ為雙電層電容［２８］。電極／溶液界面的電容Ｃ∝ｒ２０，而溶液的阻抗Ｒ∝１／ｒ０，因此，時(shí)間常數(shù)ＲＣ∝ｒ０。ｒ０減小使微電極的時(shí)間常數(shù)ＲＣ降低，充電電流ｉｃ的衰減速率變得更快，因而增加信噪比，可提高測(cè)定的靈敏度。相比之下，常規(guī)電極的尺寸大，導(dǎo)致信噪比降低，并不適合于快速的電化學(xué)反應(yīng)研究［２９］。

２.４傳質(zhì)速度快且易達(dá)到穩(wěn)態(tài)

超微圓盤(pán)電極的擴(kuò)散傳質(zhì)速率Ｍ可以用式２［３０］表示：

Ｍ＝４Ｄ／（πｒ）（２）

Ｄ為擴(kuò)散系數(shù)，ｒ?yàn)殡姌O半徑。ｒ越小，擴(kuò)散速率越快。與此同時(shí)，當(dāng)電極表面?zhèn)髻|(zhì)速率快時(shí)，反應(yīng)物向電極表面?zhèn)鬏數(shù)倪^(guò)程中不受干擾。因此，可使用微電極研究速率較快的電化學(xué)反應(yīng)［２８］。基于上述微電極傳質(zhì)規(guī)律可得到微電極的穩(wěn)態(tài)擴(kuò)散電流，公式如下：

ｉ＝４πｎＦＤｃｏｘｒ０（３）

式中，電流為穩(wěn)態(tài)電流，與氧化態(tài)物質(zhì)在溶液中的濃度（ｃｏｘ），擴(kuò)散系數(shù)（Ｄ），電極半徑（ｒ０）有關(guān)［２８］。另外，微電極的循環(huán)伏安圖呈現(xiàn)典型的Ｓ形，而不出現(xiàn)常規(guī)電極所形成的峰形。

２.５簡(jiǎn)化測(cè)量裝置

在常規(guī)電極的伏安實(shí)驗(yàn)中，為了達(dá)到體系的穩(wěn)定，常采用三電極體系進(jìn)行測(cè)量。而在微電極的體系中，對(duì)電極比微電極的面積大１０４～１０５倍，對(duì)電極上電流密度極低、基本不發(fā)生極化，因此，參比電極可同時(shí)作為對(duì)電極來(lái)使用，即在微電極體系中采用二電極體系，從而簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)裝置。

２.６存在的不足

因?yàn)槲㈦姌O尺寸小，所以制備難度大，成本較高，成功率和重現(xiàn)性也是一大難題。通過(guò)微電極的電流很小，電流大小達(dá)到ｎＡ甚至ｐＡ級(jí)別，所以檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)具有更高的信號(hào)檢測(cè)靈敏度。另一方面，由于微電極體系電流信號(hào)小，受到環(huán)境干擾大，因此，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求比常規(guī)電極體系高。目前，加工技術(shù)越來(lái)越精細(xì)，電子技術(shù)也有所提高，針對(duì)以上這些問(wèn)題，得到了較好的解決策略。

３微電極的類別與制備方法

按照不同的電極制作材料，伏安法或者安培法用的微電極主要分為非金屬微電極和貴金屬微電極兩類。非金屬微電極中多以碳超微電極、碳纖維微電極［５］和碳納米管功能化微電極為主；在貴金屬微電極中，鉑微電極和金微電極［２９］最為廣泛。最常用的電極材料中，碳纖維微電極電勢(shì)窗口寬，多應(yīng)用于水溶液體系的電分析。與貴金屬微電極相比，碳纖維微電極雙電層電容大、背景電流高，因而在檢測(cè)中信噪比較低［３１，３２］。根據(jù)微電極的形狀特點(diǎn)，微電極包含微盤(pán)電極、微圓盤(pán)電極和微環(huán)電極等［２９］。按照電極的尺寸大小，可將電極分為微電極（１００ｎｍ～２５μｍ）［１］、超微電極（１００ｎｍ～１μｍ）和納米電極（＜１００ｎｍ）［３３］。

微電極具有諸多優(yōu)異性能，越來(lái)越多的研究者對(duì)微電極產(chǎn)生了濃厚的興趣。制備微電極的傳統(tǒng)方法中多以電沉積法［７］和電化學(xué)刻蝕法［８］為主。電沉積法即為在基底上沉積電極材料或包覆層［７］。通過(guò)電沉積法制備微電極的幾何形態(tài)主要呈現(xiàn)圓錐形、半球形、球形。最近，Ｚｈａｎｇ等［３４］基于電沉積法制備不同金屬材料的電極，如金、鉑、銀和銅微電極，其電極尺寸小于１００ｎｍ，對(duì)比之前的制備方法，利用該制備方法可控制電極尺寸大小。電化學(xué)刻蝕法多以制備半球型微電極為主，如Ｐｅｎｎｅｒ小組［８］使用電化學(xué)刻蝕法制備尖端尺寸為１ｎｍ左右的電極。具體操作過(guò)程如下：首先，在一定的電位下將放置在溶液中的金屬絲進(jìn)行電化學(xué)刻蝕之后，可得到錐形的納米尖端。尖端表面填涂電泳漆、熔融玻璃、環(huán)氧ＡＢ膠等絕緣物質(zhì)之后，即可制備出半球型微電極。電化學(xué)刻蝕法成本低、儀器簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好，經(jīng)過(guò)多次絕緣之后方可得到尺寸更小的微電極，因此制備過(guò)程較為繁瑣。目前，還有一些制備微電極的技術(shù)，如自組裝技術(shù)、離子束刻蝕技術(shù)［３］、絲網(wǎng)印刷術(shù)［９］、化學(xué)鍍層技術(shù)［１０］等，這些都是快速制備微電極的方法。

３.１碳超微電極

在非金屬微電極中，碳超微電極由于其尺寸易于調(diào)控，應(yīng)用廣泛，因而引起有關(guān)研究人員的廣泛興趣。Ｕｎｗｉｎ課題組［１８］將石英毛細(xì)管拉制呈尖銳的納米尖端，外壁熱解丁烷沉積碳形成柱狀電極，其電極尺寸易于調(diào)控。該方法簡(jiǎn)單、快速，得到的電極尺寸相對(duì)較小且靈敏度高，可應(yīng)用于掃描電化學(xué)顯微鏡的探針。隨后，該課題組［３５］制備了一種半徑在５～２００ｎｍ的圓盤(pán)狀碳納米電極。將石英毛細(xì)管拉制呈尖銳的納米尖端，使用從上至下的方法制備碳納米電極，在其尖端高溫?zé)峤夂蟪练e碳，制成內(nèi)徑在５～２００ｎｍ的碳超微圓盤(pán)電極，這種電極由于尺寸易于調(diào)控，可用于單細(xì)胞檢測(cè)。在此電極上沉積鉑后可用來(lái)監(jiān)控腦片外部和內(nèi)部中的耗氧量。另外，這些納米電極可以作為掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的探針［１７］，使得活細(xì)胞中的成像具有很高的分辨率。

本課題組［３６］通過(guò)將中空的多根石英毛細(xì)管纏繞拉制形成微電極陣列支撐體，然后通過(guò)熱裂解乙炔將碳沉積于石英管內(nèi)壁形成碳的微環(huán)狀電極，構(gòu)筑了尖端為１０～５０μｍ、數(shù)目可達(dá)１５個(gè)微電極的陣列，應(yīng)用一個(gè)含有８?jìng)€(gè)微電極的微電極陣列可進(jìn)行單個(gè)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞胞吐過(guò)程中不同位點(diǎn)釋放的電化學(xué)成像研究，初步檢測(cè)到亞細(xì)胞層次的胞吐空間分布不均勻性。這一方法為單個(gè)可尋址微電極陣列的制備提供了一個(gè)全新的思路，為高通量活體分析奠定了堅(jiān)實(shí)的平臺(tái)基礎(chǔ)。

３.２碳納米管微電極

碳納米管微電極具有高機(jī)械強(qiáng)度、高長(zhǎng)徑比、良好的導(dǎo)電性等特點(diǎn)使得碳納米管已經(jīng)廣泛應(yīng)用到不同的電化學(xué)檢測(cè)中［３７，３８］。研究表明［３９］，碳納米管修飾碳纖維微電極用于神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)時(shí)，該電極上電子轉(zhuǎn)移的動(dòng)力學(xué)得到提高并且對(duì)有吸附作用的物質(zhì)的靈敏度有所提高（如多巴胺），而且電極不易受普通生物物質(zhì)的影響，例如５?羥吲哚乙酸。此外，將碳納米管固定在碳纖維微電極上，并將此電極浸泡在碳納米管?全氟磺酸的懸浮液中首次制備出了碳納米管微電極［３９］。不過(guò)，此方法重現(xiàn)性較低。進(jìn)一步的工作證明單壁碳納米管化學(xué)自組裝是在碳纖維圓盤(pán)電極上形成均勻排列的碳納米管層的一種有效方法［４０］。體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)證明碳納米管修飾的電極檢測(cè)多巴胺時(shí)靈敏度可提高３６倍。

３.３碳纖維微電極

碳纖維微電極的傳統(tǒng)制備方法是將碳纖維插入到絕緣性能良好的玻璃或者石英毛細(xì)管內(nèi)，高溫拉制成兩個(gè)具有尖端的電極，利用環(huán)氧液滴對(duì)尖端進(jìn)行密封，并暴露出尖端碳纖維，對(duì)尾端碳纖維用導(dǎo)線連通，即可成功制備。該微電極直徑（１００～６００μｍ）較小。因此，它在植入過(guò)程中對(duì)組織損傷很小，使其得到廣泛的應(yīng)用［５］。Ｔｉａｎ課題組［３２］第一次在碳纖維微電極上電沉積金納米粒子進(jìn)而檢測(cè)超氧根離子，該檢測(cè)方法具有一定的選擇性、靈敏性和穩(wěn)定性。另外，由于碳纖維微電極的生物相容性好有利于增強(qiáng)活體中超氧根離子的響應(yīng)信號(hào)。Ｍａｏ課題組［４１］制備碳纖維微電極在活體中選擇性檢測(cè)氧氣，在碳纖維表面高溫?zé)峤馓艰F然后電沉積上鉑納米粒子，此電極展現(xiàn)出快速的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，氧氣通過(guò)四電子轉(zhuǎn)移過(guò)程發(fā)生還原反應(yīng)而不形成過(guò)氧化氫。這項(xiàng)研究提供一種新穎、可靠的制備方法，用于高靈敏、高選擇性地監(jiān)控在不同生理過(guò)程中體內(nèi)的氧氣含量，微電極可用于活體測(cè)定氧氣含量。

３.４鉑微電極

在貴金屬微電極中，常使用到的是鉑微電極或者金微電極。Ｂａｒｄ小組［４２］已經(jīng)運(yùn)用電沉積法制備Ｈｇ／Ｐｔ半球電極。Ｃｈｅｎ等［４３］通過(guò)電沉積方式使得金納米粒子整齊地包被在鉑盤(pán)表面，進(jìn)而制備出鉑微電極，從而實(shí)現(xiàn)紋狀體中多巴胺含量的檢測(cè)，響應(yīng)時(shí)間短（＜２ｓ），靈敏度提高了２.６倍。Ｚｈａｎｇ等［４４］將直徑為２５μｍ的鉑線通過(guò)拉制、密封、刻蝕等操作成功制備了鉑微圓盤(pán)電極。另外，該課題組［４５］還在較低的陽(yáng)極電位下，快速地制備出覆蓋有薄層氧化鉑的微電極。Ｕｍｅｄａ等［４６］將直徑為５０μｍ的鉑線進(jìn)行高溫?zé)岱?、拋光和覆蓋一層全氟磺酸膜操作之后，制備出鉑微圓盤(pán)電極用于檢測(cè)氧還原反應(yīng)（ＯＲＲ）中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫總量。Ｌｅｅ課題組［１５］將鉑線熱封在已經(jīng)拉制好的玻璃毛細(xì)管里，在氯化鈣溶液里進(jìn)行刻蝕操作，之后電沉積上鉑黑形成鉑微圓盤(pán)電極用于檢測(cè)一氧化氮含量。因此，將鉑絲進(jìn)行拉制、密封、刻蝕、修飾等操作之后，鉑微電極即可制備而成。

３.５金微電極

金微電極的制備主要是通過(guò)在絕緣條件下埋藏一根金導(dǎo)線，并用絕緣材料密封。隨后通過(guò)電化學(xué)的刻蝕［４７］、拋光［４８］、激光拉制［４９］的方法制備成微米大小的微電極。Ｍｉｒｋｉｎ課題組［４９］通過(guò)激光拉制器減小電極尺寸，他們制備的金微電極直徑為４０ｎｍ。到目前為止，涌現(xiàn)出許多制備金微電極的方法，主要包括電沉積法、自組裝技術(shù)和化學(xué)鍍層技術(shù)。

ＤｉＬｏｒｅｎｚｏ［５０］報(bào)道了一種快速、簡(jiǎn)單、高效的電沉積方法制備金微電極，即在０.１ＭＨＡｕＣｌ４和１ＭＮＨ４Ｃｌ溶液中使用簡(jiǎn)單的電沉積方法，將該電極用于葡萄糖的檢測(cè)。Ｂａｒｄ等［２０］報(bào)道了基于金納米顆粒的自組裝功能（金納米顆粒通過(guò)二硫鍵實(shí)現(xiàn)自組裝），通過(guò)自組裝技術(shù)成功制備金球形電極。其制備過(guò)程簡(jiǎn)單，首先向拉制好的毛細(xì)管尖端空腔內(nèi)注入１，９－壬二硫醇，然后把尖端浸入金納米顆粒溶膠中，最后調(diào)節(jié)毛細(xì)管尖端大小，即可得到直徑為１～３０μｍ的球形電極。該方法反應(yīng)溫和且成本低廉。

本課題組［１２］采用無(wú)毒聚多巴胺多功能材料代替常用的（３?氨基丙基）?三乙氧基硅烷，發(fā)展了一種新穎、簡(jiǎn)便、快速的化學(xué)鍍層技術(shù)自下而上制備金環(huán)微電極的方法。如圖１所示，此金環(huán)微電極制備過(guò)程為在毛細(xì)管內(nèi)壁羥基化，毛細(xì)管內(nèi)壁自組裝上聚多巴胺層，鹽酸羥胺還原氯金酸形成金納米粒子，促使金納米粒子生長(zhǎng)并形成金膜。最終制備而得的金環(huán)微電極頂端最小直徑達(dá)到１０μｍ，可控制的金膜厚度達(dá)到２００ｎｍ～３μｍ。通過(guò)金納米粒子與巰基的自組裝可實(shí)現(xiàn)對(duì)活體中多巴胺的檢測(cè)。

Ｈｅ等［１０］提出一種制備金微電極的化學(xué)鍍層方法，主要是通過(guò)紫外照射的方法使得在聚苯乙烯板上沉積金納米粒子從而形成金微電極。如圖２所示，從低壓力汞燈發(fā)射的高能量的紫外光照在聚苯乙烯的表面上，使得在照射條件下產(chǎn)生光化學(xué)催化的羧基官能團(tuán)進(jìn)而與金納米粒子結(jié)合，最終通過(guò)化學(xué)鍍層技術(shù)形成金膜。通過(guò)在聚苯乙烯上形成金微膜，能夠準(zhǔn)確控制電極尺寸，制造成本低廉。該電極具有良好的穩(wěn)定性和優(yōu)良的電化學(xué)性能，他們將此電極應(yīng)用于多巴胺和兒茶酚胺含量的檢測(cè)和分離。

在多樣化微電極發(fā)展的基礎(chǔ)上，微電極陣列由于具有高時(shí)空分辨率，可以在同一時(shí)間從微小的空間如組織和細(xì)胞上記錄到更多的化學(xué)物質(zhì)代謝變化過(guò)程，也引起研究者廣泛關(guān)注［４］。通過(guò)單獨(dú)控制每個(gè)電極的電位可以同時(shí)檢測(cè)到不同的分析物，或者可以記錄到單個(gè)細(xì)胞表面不同空間位點(diǎn)同一化學(xué)物質(zhì)的釋放。

圖１金環(huán)微電極的制作步驟［１２］。（Ａ）拉制好的空玻璃毛細(xì)管；（Ｂ）毛細(xì)管內(nèi)壁羥基化；（Ｃ）毛細(xì)管內(nèi)壁自組裝上聚多巴胺層；（Ｄ）內(nèi)壁生長(zhǎng)金納米粒子；（Ｅ）形成金膜；（Ｆ）金環(huán)微電極尖端修飾３?巰基丙酸

圖２在聚苯乙烯薄片上制備電極的步驟圖解［１０］。（ａ）紫外照射；（ｂ）氨基；（ｃ）金納米粒子；（ｄ）金層

捕捉亞細(xì)胞水平的細(xì)胞胞吐的變化時(shí)，微電極陣列測(cè)量尺寸和電極間距必須小于細(xì)胞（一個(gè)神經(jīng)元直徑約為４～１２０μｍ）直徑大小。通過(guò)將碳纖維插入到多管玻璃中制備出碳圓盤(pán)微電極陣列和在石英毛細(xì)管內(nèi)熱解乙炔沉積碳，可分別形成７和１５個(gè)碳環(huán)微電極陣列［３６，５１］，用于檢測(cè)單細(xì)胞釋放的物質(zhì)。研究人員還利用各種微制作的方法來(lái)制備可增加電極數(shù)量的微電極陣列。此類微電極陣列可應(yīng)用在單細(xì)胞和細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中［５２，５３］。Ｗａｎｇ課題組［５２］報(bào)道了一種制備單個(gè)可尋址微電極陣列的方法，可用來(lái)檢測(cè)單個(gè)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞釋放的神經(jīng)遞質(zhì)物質(zhì)。他們發(fā)展了一種在鉑微電極陣列上修飾IV型膠原的方法，可以促進(jìn)細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)。他們?cè)O(shè)計(jì)的新裝置包含３６個(gè)微電極，微孔大小為４０μｍ×４０μｍ，此裝置可直接將體外培養(yǎng)的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞定位在傳感器的正上方。ＭｃＣａｒｔｙ等［５４］在三個(gè)凹槽里通過(guò)裂解、光刻等技術(shù)制備微電極陣列，制備方法重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性良好，該課題組將微電極陣列簡(jiǎn)單地移植到體內(nèi)中可實(shí)時(shí)記錄紋狀體中多巴胺的釋放信號(hào)。該課題組［５５］還報(bào)道了碳超微電極陣列的制備方法。裝置包括４～１６個(gè)通過(guò)熱解光致抗蝕劑制備而來(lái)的微電極，此裝置易受光刻控制，并且已經(jīng)在性能方面類似于玻碳電極。Ｃａｉ課題組［５６］構(gòu)筑了一種高靈敏的微電極陣列，并在微電極陣列上電沉積聚吡咯石墨烯，用于檢測(cè)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞釋放的多巴胺含量。該檢測(cè)方法具有高靈敏性、特異性良好、檢出限低和響應(yīng)快速等特點(diǎn)。

４微電極的活體／單細(xì)胞應(yīng)用

由于微電極尺寸小、響應(yīng)時(shí)間短、表面?zhèn)髻|(zhì)速率快、對(duì)細(xì)胞或組織損傷小，可將微電極應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，進(jìn)行單細(xì)胞分析，測(cè)定生物體內(nèi)活性物質(zhì)，進(jìn)而用來(lái)高靈敏、高時(shí)空分辨監(jiān)測(cè)一些參與生理過(guò)程的小分子物質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)中的動(dòng)態(tài)釋放，以此研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生前后的物質(zhì)變化，為生理學(xué)和病理學(xué)研究提供指導(dǎo)。由此可以看出，使用微電極可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物組織的實(shí)時(shí)、在線分析。本節(jié)詳細(xì)介紹微電極檢測(cè)神經(jīng)化學(xué)活性物質(zhì)（多巴胺、抗壞血酸、兒茶酚胺）以及小分子（過(guò)氧化氫、一氧化氮）。

４.１活體檢測(cè)

碳納米管修飾的碳纖維微電極應(yīng)用于活體分析檢測(cè)中。Ｚｈａｎｇ等［１１］用一種新的電化學(xué)方法應(yīng)用于活體腦中的抗壞血酸的檢測(cè)，如圖３所示?；谔技{米管的電化學(xué)性質(zhì)有利于抗壞血酸進(jìn)行氧化反應(yīng)，可利用多層次的碳納米管修飾碳纖維微電極檢測(cè)抗壞血酸含量，相對(duì)于鼠腦中共同存在的其他電活性的物種具有較高的選擇性，例如３，４?二羥基苯乙酸、尿酸和５?羥基色胺。此電極具有高的選擇性和良好的重現(xiàn)性。因此，可以選擇性來(lái)檢測(cè)鼠腦中的抗壞血酸含量。

圖３循環(huán)伏安法測(cè)量紋狀體中抗壞血酸含量的實(shí)驗(yàn)步驟［１１］。碳纖維微電極的掃描電子顯微鏡圖（Ａ）修飾多壁碳納米管之前；（Ｂ）修飾多壁碳納米管之后；比例尺為１μｍ

?ｚｅｌ團(tuán)隊(duì)［５７］用殼聚糖修飾的碳纖維微電極對(duì)血清素進(jìn)行選擇性檢測(cè)。圖４顯示沒(méi)有任何修飾的碳纖維微電極與殼聚糖修飾的碳纖維微電極在活體中檢測(cè)的對(duì)比。實(shí)驗(yàn)表明用未修飾碳纖維微電極記錄的氧化峰包含了抗壞血酸和血清素的電化學(xué)信號(hào)，而殼聚糖包被的碳纖維微電極可排除抗壞血酸的干擾。與未修飾碳纖維微電極相比，包被殼聚糖的碳纖維微電極對(duì)血清素具有一定的選擇性和較高的靈敏度。使用該微傳感器可測(cè)量出低濃度的血清素，檢出限為１.６ｎＭ?；铙w中的結(jié)果表明，在高空間和時(shí)間的分辨率下，殼聚糖修飾的電極可檢測(cè)斑馬魚(yú)腸中血清素［５７］。

圖４未修飾的碳纖維微電極和殼聚糖包被的碳纖維微電極在活體檢測(cè)后的微分脈沖伏安圖［５７］

除了金屬材料微電極，貴金屬微電極在活體檢測(cè)中也具有非常重要的作用。本課題組［１２］通過(guò)濕沉積技術(shù)制備金環(huán)微電極，用３?巰基丙酸修飾的金環(huán)微電極可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控活體鼠腦中兒茶酚胺的釋放，如圖５［１２］。

圖５３?巰基丙酸修飾的金環(huán)微電極記錄鼠腦紋狀體中兒茶酚胺的釋放量［１２］。（Ａ）在０.２Ｖ電壓下修飾３?巰基丙酸之前（黑線）和修飾３?巰基丙酸之后（紅線）檢測(cè)多巴胺的Ｉ?ｔ圖；（Ｂ）３?巰基丙酸修飾的金環(huán)微電極記錄鼠腦紋狀體中兒茶酚胺的釋放

Ｃｈｅｎ等［４３］使用金納米粒子和自組裝單分子層修飾鉑微電極監(jiān)控帕金森疾病的動(dòng)物模型中的多巴胺消耗量，結(jié)果表明，可提高檢測(cè)多巴胺的靈敏性和特異性，并且減小抗壞血酸的干擾。用此微電極檢測(cè)到多巴胺濃度線性范圍為０.０１～５μＭ，線性相關(guān)系數(shù)為０.９９。

Ｓｈｉ等［５８］制備出一種全氟磺酸修飾的覆蓋有金納米粒子的玻璃毛細(xì)管作為微電極并成功應(yīng)用于鼠腦紋狀體中多巴胺的選擇性檢測(cè)，如圖６所示。

圖６全氟磺酸修飾金納米粒子玻璃毛細(xì)管實(shí)時(shí)檢測(cè)鼠腦中的多巴胺含量［５８］。通過(guò)注射２０ｍｇ·ｋｇ－１的氨苯甲異喹使鼠麻醉，使用全氟磺酸修飾金納米粒子玻璃毛細(xì)管實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)鼠腦中多巴胺含量的Ｉ?ｔ圖。箭頭顯示氨苯甲異喹的注射時(shí)間

Ｂａｒｂｏｓａ等［５９］報(bào)道了一種包含４個(gè)鉑響應(yīng)點(diǎn)的覆蓋葡萄糖氧化酶的微電極陣列傳感器，如圖７所示。該傳感器用于檢測(cè)鼠腦中葡萄糖含量，具有高選擇性、靈敏性和穩(wěn)定性良好等特點(diǎn)。

圖７包含４個(gè)鉑響應(yīng)點(diǎn)并覆蓋葡萄糖氧化酶的微電極陣列傳感器的示意圖［５９］

微電極還可以設(shè)計(jì)為電位型微型傳感器進(jìn)行活體檢測(cè)研究。Ｍａｏ等［２３］基于碳纖維微電極制備了質(zhì)子選擇性微電極監(jiān)測(cè)鼠腦中ｐＨ值的變化。該電極是將含有增塑劑、氫離子載體和離子交換劑的聚氯乙烯聚合物基質(zhì)修飾于碳纖維微電極。該微電極具有很高的抗蛋白質(zhì)污染性能，能夠維持對(duì)ｐＨ值監(jiān)測(cè)的靈敏性和可逆性，在范圍較小的ｐＨ值變化（６.０～８.０）中表現(xiàn)出很好的響應(yīng)。此電極可以實(shí)時(shí)監(jiān)控活體ｐＨ值變化過(guò)程。Ｇｏｄａ課題組［２４］設(shè)計(jì)了一種Ｉｒ／ＩｒＯｘ離子選擇性微電極，在其表面非特異性吸附牛血清蛋白后監(jiān)測(cè)其電位響應(yīng)。此電極在吸附蛋白質(zhì)之后，在較寬的ｐＨ值范圍內(nèi)依然具有一定的電位響應(yīng)，并且對(duì)蛋白污染具有一定耐受性，可直接用于含有生物分子的實(shí)際樣品中的電位測(cè)量。

總之，通過(guò)在碳纖維微電極、金微電極、鉑微電極等微電極表面修飾多壁碳納米管、３?巰基丙酸、金屬納米粒子等物質(zhì)之后，可以實(shí)現(xiàn)高靈敏、高選擇地檢測(cè)活體中的抗壞血酸、多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)，檢出限低至ｎＭ級(jí)別，同時(shí)還可以應(yīng)用于電位型傳感方面的研究。

４.２單細(xì)胞檢測(cè)

不管是非金屬微電極還是貴金屬微電極都可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞檢測(cè)。Ｗｉｇｈｔｍａｎ和Ｅｗｉｎｇ等構(gòu)筑了一種圓柱形碳纖維微電極［６０，６１］，可用于電化學(xué)定量分析檢測(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞和鼠腦組織中釋放的神經(jīng)遞質(zhì)物質(zhì)。Ａｄａｍｓ等［６２］使用金納米粒子網(wǎng)狀形成的碳纖維微電極作為一種新的微電極傳感器，成功檢測(cè)出單細(xì)胞分泌的多巴胺。這種用來(lái)檢測(cè)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞分泌的多巴胺新型微電極，如圖８所示。該微電極具有使用壽命長(zhǎng)、穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)，并能顯著降低電極表面與多巴胺的聚合作用。更為重要的是，由于金納米粒子本身具有較強(qiáng)的惰性、弱的化學(xué)吸附作用、形成溶膠?凝膠網(wǎng)狀時(shí)的高度穩(wěn)定性、以及納米粒子網(wǎng)狀獨(dú)特的３Ｄ結(jié)構(gòu)等特殊性質(zhì)，可大幅度提高傳感器的靈敏度。

圖８碳纖維微電極與金納米顆粒網(wǎng)狀電極檢測(cè)單細(xì)胞胞外釋放的多巴胺［６２］

本課題組［３６］報(bào)道了一種新型、簡(jiǎn)便的方法來(lái)制備碳環(huán)微電極陣列。這類微電極陣列應(yīng)用于單一嗜鉻細(xì)胞瘤胞外分泌多位點(diǎn)傳感時(shí)，可檢測(cè)出單一的神經(jīng)元細(xì)胞或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。其制備過(guò)程簡(jiǎn)單、快速，如圖９所示。此外，還可調(diào)控陣列管中電極的數(shù)量，已報(bào)道出單一的陣列頂端可容納８～１５個(gè)電極。這些電極具有十分良好的電化學(xué)性能和重現(xiàn)性，使得其在單細(xì)胞分析檢測(cè)方面具有常規(guī)微電極無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)。

圖９碳環(huán)微電極陣列用于細(xì)胞檢測(cè)［３６］

使用火焰刻蝕法制備微電極實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞檢測(cè)也是當(dāng)下的一個(gè)研究熱點(diǎn)。利用該方法制備出的微電極電化學(xué)活性面積較大，可直接插入到細(xì)胞里進(jìn)行檢測(cè)［６３］。相比圓柱形的碳纖維微電極，這些電極具有更高的靈敏度，能顯著改善動(dòng)力學(xué)參數(shù)并對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)具有快速的響應(yīng)［６４］。Ｅｗｉｎｇ等［１４］將具有納米尺寸尖端的碳纖維微電極直接應(yīng)用于檢測(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞中分泌的兒茶酚胺量，如圖１０所示。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的測(cè)量來(lái)說(shuō)，尖端納米尺寸的圓錐形碳纖維微電極可以穿過(guò)細(xì)胞膜并對(duì)膜沒(méi)有損壞。

圖１０頂端納米尺寸的碳纖維微電極檢測(cè)單個(gè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞顯微鏡圖［１４］。（ａ）示意圖（橙色的小圓圈代表囊泡）；（ｂ）尖端為納米尺寸的圓錐形的碳纖維微電極檢測(cè)單個(gè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞顯微鏡圖

微電極作為電位型傳感還可以應(yīng)用在單細(xì)胞檢測(cè)中，Ｎｇ等［２５］報(bào)道氧化銥微電極用于監(jiān)測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中急性、局部的ｐＨ值變化，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)代謝反應(yīng)，有助于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的相互作用。Ｔｈｕｎｄａｔ課題組［２６］制備了一種靈敏、生物相容性好的納米纖維電位型傳感器，可用于研究癌細(xì)胞的代謝活動(dòng)，還可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞外的ｐＨ值變化。同時(shí)，它可用于監(jiān)測(cè)癌細(xì)胞的化學(xué)耐藥性，對(duì)未來(lái)發(fā)展新的抗癌藥物具有潛在意義。

微電極不僅能夠檢測(cè)生命系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)，還能檢測(cè)一些生命體能量代謝物質(zhì)和調(diào)質(zhì)類小分子物質(zhì)及自由基等。

基于鉑納米粒子對(duì)過(guò)氧化氫良好的電化學(xué)催化作用［６５］，Ｈｕａｎｇ等［１３］報(bào)道了一種金／鉑粒子混合納米結(jié)構(gòu)自組裝的金微線微電極，發(fā)展了一種高靈敏度、高空間和高時(shí)間分辨率的傳感器應(yīng)用于人類乳腺癌細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的檢測(cè)。電催化可還原過(guò)氧化氫，檢出限低至０.３ｎＭ。微電極超小的幾何尺寸、高靈敏度，能夠?qū)崟r(shí)準(zhǔn)確監(jiān)控出乳腺癌細(xì)胞中過(guò)氧化氫的釋放，如圖１１所示。基于以上特點(diǎn)，微電極已經(jīng)在生理學(xué)和病理學(xué)的應(yīng)用方面展現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。Ｚｈｅｎｇ等［６６］制備鈀納米粒子包被的碳納米管纖維微電極進(jìn)而檢測(cè)過(guò)氧化氫含量，其檢測(cè)過(guò)程響應(yīng)快速（２ｓ），檢出限低至２μＭ，該電極對(duì)過(guò)氧化氫的檢測(cè)具有高靈敏度和選擇性。Ｗａｎｇ等［６７］通過(guò)電沉積方法在碳纖維微電極上沉積鉑納米粒子制備出的電極，對(duì)于過(guò)氧化氫具有一定的催化能力，檢測(cè)范圍寬（０.０４４～１２.３０ｍＭ），進(jìn)而可以檢測(cè)出細(xì)胞瘤釋放的過(guò)氧化氫含量。

圖１１金／鉑粒子混合納米結(jié)構(gòu)的微電極檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞釋放的過(guò)氧化氫Ｉ?ｔ曲線［１３］。（ａ）在丙二醇甲醚醋酸酯（ＰＭＡ）刺激下從６個(gè)ＭＣＦ?７細(xì)胞中釋放Ｈ２Ｏ２；（ｂ）從單個(gè)ＭＣＦ?７細(xì)胞中釋放Ｈ２Ｏ２；（ｃ）細(xì)胞與過(guò)氧化氫酶孵化之后在ＰＭＡ刺激之后ＭＣＦ?７細(xì)胞釋放過(guò)氧化氫；（ｄ）在磷酸緩沖鹽溶液刺激下ＭＣＦ?７細(xì)胞釋放過(guò)氧化氫

一氧化氮是神經(jīng)、心血管系統(tǒng)細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子，作為第二信使和神經(jīng)傳遞物質(zhì)在生命體系中同樣發(fā)揮著重要的角色。發(fā)展一種快速并且具有一定靈敏性的傳感器在生物體中檢測(cè)一氧化氮具有十分重要的意義。目前，光學(xué)和電化學(xué)方法是檢測(cè)一氧化氮的兩種主要方法［６８～７０］。電化學(xué)傳感器具有檢出限低、響應(yīng)快速、制備簡(jiǎn)單、尺寸小等特點(diǎn)，并且在生物樣品中能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)一氧化氮的濃度［７１～７３］，因此，發(fā)展電化學(xué)傳感器來(lái)高效、靈敏地檢測(cè)一氧化氮引起了人們的廣泛興趣。

金屬納米材料具有較快的電子傳遞和一定催化效果等特點(diǎn)，被廣泛用來(lái)合成傳感器監(jiān)測(cè)一氧化氮的釋放。目前，已經(jīng)構(gòu)筑出金納米粒子、鉑納米粒子類的傳感器來(lái)檢測(cè)一氧化氮。貴金屬具有優(yōu)異的特性，近幾年來(lái)被廣泛應(yīng)用在不同的領(lǐng)域［７４，７５］。其中，金屬納米材料具有較快的電子傳遞和催化效果等特點(diǎn)，被廣泛用來(lái)制備傳感器監(jiān)測(cè)一氧化氮的釋放，例如已經(jīng)構(gòu)筑出金納米粒子［７６，７７］、鉑納米粒子［７８］類的傳感器來(lái)檢測(cè)一氧化氮。Ｈｕ等［７９］通過(guò)一種簡(jiǎn)單的化學(xué)液相沉積法在石英纖維上生長(zhǎng)金納米粒子薄膜，制備出了一種新型的金纖維微電極。通過(guò)電聚合上煙酰胺和全氟磺酸后，這種一氧化氮微傳感器靈敏度高、檢出限低至３.６ｎＭ，可成功用于檢測(cè)小鼠肝細(xì)胞中的一氧化氮的釋放。Ｈｅｎｒｙ等［８０］制備鉑微電極來(lái)檢測(cè)一氧化氮，進(jìn)一步提高了電極抗污染能力，檢測(cè)限為９０ｎＭ～１μＭ。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等［８１］使用金納米粒子修飾的碳超微電極陣列，對(duì)一氧化氮的檢測(cè)具有一定的選擇性和靈敏度，并且此電極對(duì)于一氧化氮氧化具有一定的催化能力。

針對(duì)單細(xì)胞檢測(cè)，對(duì)于電極的尺寸和性能有更高要求，微電極可適用于單細(xì)胞物質(zhì)檢測(cè)的諸多方面。相比貴金屬微電極，因其具有良好的生物相容性和較低的制作成本，碳纖維微電極更適用于單細(xì)胞檢測(cè)。此外，通過(guò)在貴金屬微電極表面修飾上納米粒子也可以實(shí)現(xiàn)低檢測(cè)限檢測(cè)過(guò)氧化氫、一氧化氮等小分子。

５結(jié)論

隨著電子技術(shù)的高速發(fā)展，制備出的微電極最小極限直徑在不斷減小。但是在實(shí)際生物樣品檢測(cè)過(guò)程中，微電極表面易發(fā)生吸附、鈍化等物理現(xiàn)象以及傳質(zhì)過(guò)程引起的擴(kuò)散、對(duì)流、電滲透等電化學(xué)現(xiàn)象，都會(huì)不同程度的影響檢測(cè)時(shí)的靈敏度和選擇性。另外，在電極表面修飾的某些材料會(huì)因時(shí)間推移而褪去，從而降低微電極的性能。關(guān)于實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中碳纖維的降解是否會(huì)改變電極的響應(yīng)；如何減小活體分析時(shí)微電極的植入對(duì)于組織造成的不可避免的損傷；活體檢測(cè)的復(fù)雜性及待測(cè)物質(zhì)與干擾物質(zhì)相互影響作用等問(wèn)題仍然亟待解決［５］。

目前，微電極的發(fā)展更側(cè)重對(duì)微小尺度結(jié)構(gòu)的研究［８２］，微電極的發(fā)展趨勢(shì)是制備出納米級(jí)別的電極，進(jìn)而獨(dú)立發(fā)展成納米電子學(xué)學(xué)科［８３］。此外，可將成熟的金、鉑微電極的制備方法拓展到其他金屬材料上，以進(jìn)一步開(kāi)展新的微納傳感器應(yīng)用研究。通過(guò)改進(jìn)已有的制備技術(shù)，集成具有高通量分析性能的微電極陣列可同時(shí)檢測(cè)和分析多種組分。研究如何實(shí)現(xiàn)微電極的傳感器尺寸的納米化，并應(yīng)用在單細(xì)胞與活體分析研究中，可以使得微傳感器呈現(xiàn)出更多的生物分析空間兼容性，從而在基礎(chǔ)生物學(xué)和醫(yī)療領(lǐng)域中發(fā)揮更大作用。另外，可以擴(kuò)展微電極材料的范圍至更多功能性材料或者擴(kuò)展成３Ｄ結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)微電極在更多的領(lǐng)域中發(fā)揮出最大的價(jià)值。