數(shù)據(jù)分析

GRAPHPAD PRISM 5.0（GRAPHPAD Software Inc.，圣地亞哥，加利福尼亞州，美國）用于單因素或雙因素方差分析（Tukey或Bonferoni事后檢驗）和學(xué)生t檢驗，以比較均值。在水下凈光合作用與外部CO2或O2濃度的實驗中，也使用GRAPHPAD PRISM將數(shù)據(jù)集擬合到預(yù)測模型（高斯和Michaelis-Menten）。

結(jié)果

黎明和黃昏時葉片有機酸和可滴定組織酸度

黎明和黃昏蘋果酸或可滴定組織酸度的比較是CAM活性的診斷測試（Lu–ttge，2004），因此，我們在澳大利亞鳶尾的葉綠葉部分（即綠色葉尖）測量了這些參數(shù)。與黃昏相比，黎明時蘋果酸濃度高9.7倍，表明CAM活性（圖2）。檸檬酸鹽濃度在黎明時也較高，盡管晝夜振幅低得多（1.9倍），黎明時的絕對濃度僅為蘋果酸的24%（圖2）。葉勻漿的可滴定酸度從黎明時的250變化到黃昏時的4 lmol H+當(dāng)量g）1 FW（圖3），支持了存在大量CAM活性的結(jié)論。此外，當(dāng)?shù)味ㄩ_始于或低于蘋果酸的第一個pKa時，D蘋果酸與D酸度的比率為0.46，接近預(yù)期值0.50。因此，蘋果酸是用于儲存夜間固定二氧化碳的主要有機酸（圖2）。

圖2沉水水韭葉片中的有機酸（蘋果酸和檸檬酸）。在黑暗前16小時后的黎明（開放柱）或在光線下8小時后的黃昏（封閉柱）對組織進(jìn)行采樣。條形代表平均值±SE（n=4）***蘋果酸和檸檬酸的黎明和黃昏值顯著不同（P<0.001；Student t檢驗）。

不同蘋果酸狀態(tài)葉片水下凈光合作用對溶解CO2的響應(yīng)

已假設(shè)CAM的存在可以在沉水植物中外部CO2較低時維持凈光合作用（Madsen，1987）。我們通過比較蘋果酸高（黎明）或低（黃昏）葉片的CO2響應(yīng)曲線來測試CAM活性的潛在益處。水下凈光合作用的CO2飽和速率在高蘋果酸和低蘋果酸葉片之間沒有差異，在這兩種情況下均為2.3 lmol O2 m）2 s）1（圖4）。高蘋果酸和低蘋果酸葉片的響應(yīng)曲線在300 mmol CO2 m）3及以下顯著偏離，低蘋果酸葉片的水下凈光合作用較低。蘋果酸含量高的葉片水下凈光合速率高，這可能與蘋果酸脫羧更多導(dǎo)致的CO2更高可用性有關(guān)。

圖4水下凈光合作用與20℃下140 mmol O2 m）3培養(yǎng)的浸沒水韭葉片中外部CO2濃度的關(guān)系。在黑暗前16小時的黎明（高蘋果酸，開放圓圈）或在光線下8小時后的黃昏（低蘋果酸，封閉圓圈）對組織進(jìn)行采樣。每個數(shù)據(jù)點代表平均值±SE（n=5）。數(shù)據(jù)擬合到具有y軸常數(shù)的Michaelis-Menten模型。

表觀光呼吸的評估；對比蘋果酸狀態(tài)下葉片水下凈光合對O2的響應(yīng)

沉水植物的光呼吸可能很高，尤其是當(dāng)CO2耗盡且O2增加遠(yuǎn)高于空氣平衡時，因此Rubisco的CO2:O2比率較低。由于CAM可以抑制陸生植物的光呼吸（Lu–ttge，2002），我們評估了蘋果酸含量高或低的南花薊馬葉片的光呼吸是否不同。通過研究增加O2對水下凈光合作用速率的影響來評估表觀光呼吸（圖5）。

圖5.水下凈光合作用與水下水韭葉片中外部O2濃度（孵化期間的平均值）的關(guān)系，該葉片取自水下水韭，并在20℃下用30 mmol CO2 m）3孵化。在前一個黑暗16小時后的黎明（高蘋果酸，開放圓圈）或在光照8小時后的黃昏（低蘋果酸，封閉圓圈）對組織進(jìn)行采樣。每個數(shù)據(jù)點代表平均值±SE（n=5），數(shù)據(jù)擬合到高斯模型。20℃時，O2在水中的空氣平衡為284 mmol m）3。

蘋果酸含量低的葉片的表觀光呼吸顯著高于蘋果酸含量高的葉片；當(dāng)溶解氧濃度為空氣平衡濃度的2.2倍（即625 mmol m）3時，低蘋果酸組織的凈光合作用為負(fù)值，而高蘋果酸組織的凈光合作用雖然降低，但仍為正值（圖5）。當(dāng)溶解的O2處于空氣平衡時，低蘋果酸葉片的光呼吸甚至顯著；空氣平衡時的凈光合作用僅為這些葉片最大速率的31%——凈光合作用速率在140 mmol O2 m）3時最高，約為空氣平衡時溶解O2濃度的一半。在高蘋果酸葉片中，雖然凈光合作用在溶解氧濃度為160 mmol m）3時最大，但當(dāng)O2處于空氣平衡時，凈光合作用僅降低到最大速率的67%。此外，在這種含30 mmol CO2（m）3的溶液中，高蘋果酸葉片的最大水下凈光合作用是低蘋果酸葉片的1.5倍。在284 mmol O2 m）3下，凈O2產(chǎn)生量（即表觀光呼吸）的減少超過Rd（Rd=0.14±0.02 lmol O2 m）2 s）1的5.7倍；n=4），因此推斷的光呼吸明顯超過Rd。除了在高O2下凈光合作用下降外，在最低測試O2濃度（25 mmol m）3下也下降，可能是由于組織缺氧?？傊S著CO2:O2的減少，具有高CAM的葉片（即高蘋果酸葉片）表現(xiàn)出較低的表觀光呼吸，因此CAM脫羧作用較低。

圖6在低（c.0.5空氣平衡；140 mmol m）3）或高（2.2倍空氣平衡；625 mmol m）3）外部O2濃度下測得的從水韭（a）或在空氣中形成的葉子（b）中采集的葉子的水下凈光合作用。在20°C下對黎明時采集的葉片（高蘋果酸，開放條）在黑暗中16小時后進(jìn)行測量，或在黃昏時采集的葉片（低蘋果酸，封閉條）在光線下8小時后進(jìn)行測量。條形代表平均值±SE（n=4），字母表示組織類型和治療之間的顯著差異（P<0.05）。

空氣中形成的葉片的水下凈光合作用

當(dāng)幾種水韭物種出現(xiàn)在水面上時，在空氣中形成的葉子會形成氣孔，它們在C3光合作用中直接利用大氣中的CO2，而CAM活性則會喪失，這可以通過低D酸度來證明（Keeley等人，1983a，b）。南方水韭也能夠與暴露在空氣中的枝條一起生長，但在空氣中形成的葉片仍然缺乏氣孔，盡管葉片周轉(zhuǎn)量約為1葉wk）1（Keeley，1983b）。我們評估了在空氣中形成的葉片的氣孔、鈣調(diào)素活性和水下凈光合作用的存在情況（植物脫浸水6周），并與在水下形成的葉片（持續(xù)浸水）進(jìn)行了比較。在浸水基質(zhì)中，葉片在空氣中放置6周的植物，沒有氣孔?？諝庵行纬傻娜~片中蘋果酸濃度在黎明時也保持較高（103±21 lmol g）1 FW；平均值±SE，n=3；參143±15 lmol g）1 FW在沉水植物葉片中；圖2）。當(dāng)測試在空氣中形成的葉片對水下凈光合作用的影響時（圖6），發(fā)現(xiàn)黎明時采集的樣本（蘋果酸含量高）比黃昏時采集的樣本（蘋果酸含量低）受影響較小，這進(jìn)一步證明了在空氣中形成的葉片中存在大量CAM活性。與水下葉片觀察到的模式類似，在外部O2升高的情況下，低蘋果酸葉片（黃昏）的水下凈光合作用受到強烈限制；這些蘋果酸含量低的葉片表現(xiàn)出O2的凈消耗（高表觀光呼吸；圖6）。總之，在空氣中形成的葉子維持CAM活性。

討論

本研究評估了CAM對受到低CO2和高O2濃度挑戰(zhàn)的植物水下凈光合作用的影響，這些條件通常存在于濕地和巖石池中，可能導(dǎo)致高光呼吸。比較了高蘋果酸濃度和低蘋果酸濃度（即預(yù)期分別具有高脫羧率和低脫羧率）的水生物種即australis的葉子。CAM活性高的葉片保持較高的水下凈光合作用，尤其是在較低的外部CO2濃度下，并且具有較低的表觀光呼吸，尤其是當(dāng)O2濃度增加時。這些發(fā)現(xiàn)證明了CAM光合作用對沉水植物的潛在益處，因為水下CO2和O2濃度的波動可能很大（Van等人，1976年）。例如，日出后，水中的CO2濃度通常會隨著時間的推移而降低，O2濃度會隨著時間的推移而增加，日落后，情況會相反（Keeley&Rundel，2003）。

CAM導(dǎo)致的光呼吸減少可能與生長在動態(tài)CO2和O2濃度棲息地中的I.australis和其他水生物種有關(guān)。淺季節(jié)性游泳池的溶解氧晝夜變化劇烈，下午濃度高（西澳大利亞臨時花崗巖巖游泳池為35 kPa（數(shù)據(jù)未顯示），加利福尼亞春季游泳池為30 kPa（Keeley，1983a））。水柱的這種過飽和將顯著限制澳大利亞鳶尾的水下光合作用，但對蘋果酸濃度高的葉片影響較小（圖5和6）。然而，由于水中的O2濃度未達(dá)到空氣平衡濃度的2.2倍，預(yù)計CAM活性對光呼吸的原位保護(hù)將在圖5和6所示的極限范圍內(nèi)，當(dāng)下午晚些時候O2濃度最高時，大部分蘋果酸通常已經(jīng)脫羧基（Keeley等人，1983a）。然而，由于即使在O2的亞大氣平衡條件下，CAM也會限制光呼吸（圖5），因此預(yù)計CAM在抑制光呼吸方面的有益作用仍會在當(dāng)天早些時候出現(xiàn)。澳大利亞I.australis中的高CAM活性可能表明，澳大利亞臨時花崗巖巖池是CCMs，尤其是CAM對維持高水下光合作用至關(guān)重要的環(huán)境。CCMs在巖石池中的重要性進(jìn)一步得到共生物種中的光合途徑的支持（克拉蘇拉natans，CAM；Eleocharis，CAM和有時C4的物種；Marsilea的物種，未知但不是CAM；Keeley，1998a，b）。

長期以來，基于與缺乏CCM的水生物種相比，具有CCM的水生物種水下凈光合作用的CO2補償點較低，人們一直認(rèn)為CCM會減少水生植物的光呼吸（Salvucci&Bowes，1983；Madsen，1987）。在這里，在O2濃度范圍內(nèi)測量可用于脫羧的蘋果酸量不同的組織的水下凈光合作用，可以評估表觀光呼吸（圖5）。光呼吸隨著凈O2產(chǎn)生率的下降而明顯（光呼吸相對于光合作用增加），甚至在培養(yǎng)基中（因此在葉片內(nèi)）高O2:CO2時O2的凈消耗。與蘋果酸濃度高的葉片相比，蘋果酸濃度低的葉片的表觀光呼吸顯著更高；例如，即使在空氣平衡的O2溶液中，低蘋果酸葉片中的光呼吸已經(jīng)相當(dāng)顯著（凈O2生成量減少到最大值的31%）。CAM是一種非常有效的CCM；例如，蘋果酸脫羧可導(dǎo)致沉水單花濱藜的腔隙中的CO2濃度高達(dá)30000ppm（Madsen，1987）；這種CO2濃度比大氣濃度高85倍，有望在Rubisco產(chǎn)生有利的CO2:O2比，減少光呼吸。

水韭葉片中的鈣調(diào)素活性隨季節(jié)和環(huán)境而顯著變化。例如，與夏末相比，bolanderi水韭在春季的CAM活性要低得多（Keeley等人，1983b），與季節(jié)性池塘相比，從寡營養(yǎng)湖泊采樣時，howellii水韭的組織酸度日變化較小（圖3，Keeley等人，1983a）。將目前的結(jié)果與其他已發(fā)表的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較也表明，澳大利亞錐蟲中的CAM活性可以高度可變（圖3）；D蘋果酸的范圍從c.25（Keeley，1983b）到140 lmol g）1 FW（本研究），D蘋果酸的后一個值是水韭屬的第二高值。然而，對于I.australis來說，D蘋果酸的一些變化可以通過我們對葉子的葉綠素部分進(jìn)行的組織分析來解釋，而其他研究可能使用了整個葉子，包括有時占葉子很大一部分的無色素部分（Keeley等人，1984）。即便如此，只有從加利福尼亞州馬瑟池采集的霍韋利氏錐蟲顯示出較高的D組織酸度和D蘋果酸。

圖3水韭屬植物（水韭屬，小圓；水韭屬，大圓；水韭屬，正方形）葉片中組織可滴定酸度與D蘋果酸的變化（D）。D可滴定酸度和D蘋果酸的計算方法為黎明（am）減去黃昏（pm）。回歸線基于整個數(shù)據(jù)集，斜率為0.46。數(shù)值來自Keeley（1983b）和本研究（兩個參數(shù)的平均值±SE）；僅包括通過滴定至pH 6.4確定可滴定酸度的值。該圖由Keeley（1998a）修改并重新繪制，添加了本研究的值，以強調(diào)物種內(nèi)組織蘋果酸和可滴定酸度的范圍。因此，I.australis和I.howellii使用大符號突出顯示。

CAM是水生植物水下光合作用的重要CCM的結(jié)論得到了植物在水下時的誘導(dǎo)支持，但當(dāng)葉子出現(xiàn)在空氣中時會受到抑制；例如，在水韭屬物種中（Keeley等人，1983a），Littorella（Robe&Griffiths，2000），Orcuttia calafornica和Orcuttia viscida（Keeley，1998b）。在本研究中，I.australis在空氣中形成的葉片中保持CAM活性（圖6），這些葉片不形成氣孔，這一反應(yīng)類似于半邊蓮，半邊蓮在空氣中也不形成氣孔（Pedersen&Sand Jensen，1992）。由于在整個生長季節(jié)，臨時淺層花崗巖巖池可能會以不可預(yù)測的方式干涸和重新填充，因此，I.australis的自然環(huán)境可能會選擇這種更為保守的“結(jié)構(gòu)性CAM策略”，當(dāng)旱季開始時，在沉積物也干化和植物干燥之前，空氣中有葉子的突現(xiàn)階段可能持續(xù)很短（天）。這兩種環(huán)境特征可能意味著，在CAM和C3之間來回切換幾乎沒有益處。

綜上所述，利用棲息在臨時花崗巖露頭上的季節(jié)性水池中的一種CAM物種I.australis，本研究表明，在低外部CO2濃度下，蘋果酸脫羧含量高的葉子不僅增強了水下凈光合作用，而且明顯的光呼吸也受到CAM的抑制。在溶解氧濃度范圍內(nèi)（包括低于空氣平衡的值）明顯抑制表觀光呼吸，本研究表明，具有CAM的水生物種的光呼吸受到顯著抑制。

致謝

非常感謝Dion Nichol幫助獲得許可，對Allan和Craig Nichol在Mukinbudin的房產(chǎn)進(jìn)行花崗巖巖池調(diào)查和工作。我們還感謝CLEAR、Villum Kann Rasmussen卓越中心和丹麥科學(xué)理事會的財政支持。