概要

?水生植物的水下光合作用通常受到CO2可用性低的限制，光呼吸可能很高。一些水生植物利用景天酸代謝（CAM）光合作用。評(píng)估了CAM對(duì)增加水下光合作用和抑制光呼吸的益處，水韭是一種生活在淺臨時(shí)巖石池中的沉水植物。

?在CO2和O2濃度范圍內(nèi)，評(píng)估蘋果酸含量高或低的葉片的水下凈光合作用和表觀光呼吸。

?與黃昏相比，黎明時(shí)葉片蘋果酸含量高出9.7倍，并且葉片可滴定酸度（1mol H+當(dāng)量）的變化也表明了CAM活性。蘋果酸含量高的葉片在較低的外部CO2濃度下不僅表現(xiàn)出較高的水下凈光合作用，而且表現(xiàn)出較低的表觀光呼吸。在O2濃度范圍內(nèi)，包括低于空氣平衡的值，CAM對(duì)表觀光呼吸的抑制很明顯。在2.2倍于大氣平衡濃度的高O2濃度下，凈光合作用顯著減少，盡管在蘋果酸濃度高的葉片中保持正光合作用，但在蘋果酸濃度低的葉片中變?yōu)樨?fù)光合作用。

?水生植物中的CAM通過增加CO2固定和抑制光呼吸，在洪水中的大O2和CO2濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)更高的水下凈光合作用速率。

介紹

沉水水生植物表現(xiàn)出一系列促進(jìn)無機(jī)碳吸收的適應(yīng)性，因?yàn)榕c空氣相比，水中氣體擴(kuò)散緩慢，大大阻礙了水下光合作用的碳獲取。形態(tài)適應(yīng)包括絲狀葉，以減少擴(kuò)散邊界層的厚度，以及薄或缺失的角質(zhì)層，以降低從水中吸收二氧化碳的阻力（Maberly和Madsen，2002）。此外，一些植物可以利用替代的CO2源；例如，浮葉直接接觸大氣CO2，而大滲透根系接觸沉積物CO2（Maberly&Madsen，2002）。應(yīng)對(duì)洪水中低CO2可用性的生理適應(yīng)包括在Rubisco增加CO2，通常稱為碳濃縮機(jī)制（CCMs）（Maberly&Madsen，2002；Raven等人，2008）；這些是碳酸氫鹽使用（Prins和Elzenga，1989）、C4光合作用（Magnin等人，1997）、C3-C4中間體（Keeley，1999）和景天藍(lán)酸代謝（CAM）光合作用（Keeley，1981；Madsen，1985；Raven等人，1988）。

除了增強(qiáng)水下光合作用外，CCMs還可能減少沉水水生植物的光呼吸（Maberly和Madsen，2002）。光呼吸源于Rubisco的加氧酶活性，并由低CO2:O2比率促進(jìn)（Ogren，1984；Sage，2004）。水生環(huán)境中的低CO2可用性本身降低了CO2:O2比率；此外，由于O2在水中的可溶性比CO2低28.5倍（Baranenko等人，1990年），O2往往在白天在光合組織的氣體空間內(nèi)積聚，因?yàn)橄蛑車芤旱奶右菘赡芎苈˙owes，1993年）。因此，使用CAM等CCMs，可以在Rubisco維持更有利的CO2:O2比，從而減少光呼吸。與缺乏CCMs的物種相比，具有CCMs的水生植物光呼吸減少的推斷基于較低的CO2補(bǔ)償點(diǎn)（Salvucci&Bowes，1983；Madsen，1987）；缺乏對(duì)具有CAM的水生植物光呼吸的直接評(píng)估。

水生植物中的CAM（Keeley，1998a）與陸生植物中的CAM（Lu–ttge，2002）一樣，涉及夜間將CO2固定到蘋果酸中，然后在白天將蘋果酸脫羧，從而將CO2供應(yīng)到C3途徑，而不需要外部CO2同時(shí)向內(nèi)擴(kuò)散。水生植物中的鈣調(diào)素首次被報(bào)道用于howellii水韭（Keeley，1981），隨后被證明出現(xiàn)在大多數(shù)水韭物種中，以及在厚殼水韭屬、Eleocharis屬、Littorella屬、慈姑屬和Scirpus屬的一些物種中（Keeley，1998a）。CAM活性由蘋果酸濃度的大日波動(dòng)表示，通常測(cè)量為組織提取物可滴定酸度的變化（Keeley，1998a）。在水韭物種中，夜間固定的CO2可能占固定無機(jī)碳的50%，但物種內(nèi)部和物種之間存在巨大差異（Keeley，1983a，1985）。當(dāng)水分消退時(shí)，大多數(shù)水韭物種形成缺乏CAM的“氣生葉”并形成氣孔（Keeley等人，1983a，b），強(qiáng)調(diào)CAM在沉水水生植物中作為CCM的作用。

CAM光合作用在同工酶中尤其頻繁（Raven等人，1988年；Keeley，1998a）。水韭是一種水生植物，葉子短而硬，呈蓮座狀排列（Hutchinson，1975），通常具有厚表皮；當(dāng)被淹沒時(shí)，它們?nèi)狈饪祝⑶揖哂写蟮那幌?，為氣體擴(kuò)散提供了低阻力的途徑。根通常不分枝，占植物總質(zhì)量的50%或更多（Hutchinson，1975）。水韭通常棲息在無機(jī)碳含量低的寡營(yíng)養(yǎng)軟水湖（Smolders等人，2002年），因此利用沉積物CO2池的能力尤其有利（Maberly和Madsen，2002年）。水韭還可能占據(jù)高海拔濕地（主要是水韭屬；Keeley，1998a）或季節(jié)性濕地，如沙丘（Littorella uniflora；Pedersen等人，2006）和臨時(shí)池（雨水補(bǔ)給的巖石池；水韭屬；Keeley，1998a）。在這些植物生物量高、水量相對(duì)較低的棲息地中，溶解CO2的日變化較大，CAM是最常見的CCM（Keeley&Rundel，2003；Raven等人，2008）。

本研究使用CAM同工酶物種澳大利亞水韭（Keeley，1983b）檢驗(yàn)了兩個(gè)假設(shè)。首先，與蘋果酸含量低的葉片相比，蘋果酸含量高的葉片表現(xiàn)出增強(qiáng)的水下凈光合作用，尤其是在低外部CO2濃度下。其次，基于低CO2補(bǔ)償點(diǎn)（Salvucci&Bowes，1983；Maberly&Madsen，2002），在實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了CAM降低光呼吸的長(zhǎng)期假設(shè)，在實(shí)驗(yàn)中測(cè)量了水下凈光合作用和表觀光呼吸，同時(shí)操縱了外部CO2和O2濃度。數(shù)據(jù)表明，在較低的外部CO2濃度下，蘋果酸含量高的組織增強(qiáng)了水下凈光合作用，而CAM也減少了明顯的光呼吸。

材料和方法

植物材料

2009年10月，從西澳大利亞珀斯以東約400公里的臨時(shí)淺花崗巖巖池（圖1；118.2896E，30.7468S）收集了澳大利亞水韭的完整草皮（20厘米寬，2厘米深；該深度對(duì)池中幾乎所有的淺層沉積物進(jìn)行了采樣）。草坪在4.5升白色塑料容器中暴露在塑料下的空氣中運(yùn)輸?shù)界晁沟娜斯夂蚴遥ㄒ归g15℃，白天20℃）。

圖1澳大利亞西南部的臨時(shí)花崗巖巖池（a）和典型的水下植被（b）。臨時(shí)巖石池每年冬天都會(huì)有雨水供應(yīng)，持續(xù)3-5個(gè)月。水淺（5–10 cm），電導(dǎo)率低（<10–80 lS cm）1）；沉積物由風(fēng)化花崗巖組成，有機(jī)質(zhì)含量低（2.3±0.6%DW；n=5），深度通常小于2 cm。然而，密集的水韭種群通常會(huì)發(fā)育（b），并且可以與其他植物（舌苔屬、厚殼水韭、Marselia和Eleocharis）共存，這是臨時(shí)花崗巖巖池的典型特征（Tuckett等人，2010）。巴，5厘米。

大多數(shù)實(shí)驗(yàn)使用的是沉水培養(yǎng)的植物，在“人工洪水”（定義見下文）表面以下3-5厘米處，蒸發(fā)后注入去離子水。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將之前完全浸沒的植物去浸沒，并將其在浸水的沉積物中保持6周，枝條在空氣中。將在空氣中形成的葉子與連續(xù)浸水處理的植物進(jìn)行比較。人工洪水是一種最終電導(dǎo)率為85 lS cm）1的溶液，由去離子水（單位：mol m）3組成：0.15 Ca2+、0.10 Mg2+、0.10 K+、0.30 Cl）、0.10 SO42）和0.10 HCO3）。該低EC溶液旨在模擬采集樣本的臨時(shí)巖石池中的水。在人工氣候室中，I.australis繼續(xù)生長(zhǎng)，葉片周轉(zhuǎn)率約為1葉wk）1。每周移去舌苔屬和厚殼屬的幼苗，以維持澳大利亞鳶尾的單作。采集草坪后，使用葉組織長(zhǎng)達(dá)6周。

水下凈光合作用–CO2響應(yīng)

使用Colmer&Pedersen（2008）中描述的方法測(cè)量了葉片的水下凈光合作用。切除無無色素白色基部的葉尖（5-10毫米）（以下簡(jiǎn)稱“葉子”），并將其放置在帶有塞子的玻璃瓶中（10毫升）。每個(gè)小瓶在培養(yǎng)基中含有兩片葉子，以及兩個(gè)玻璃珠，當(dāng)小瓶在照明水浴（20C）內(nèi)的輪子上旋轉(zhuǎn)時(shí)用于混合。浸沒玻璃瓶?jī)?nèi)的光合有效輻射（標(biāo)準(zhǔn)桿數(shù)）為350 lmol m）2 s）1（使用4p US-SQS?L測(cè)量；Walz，Effeltrich，Germany）。

培養(yǎng)基的成分與人工洪水（如前一節(jié)所述）相同，但KHCO3的含量不同（本段將進(jìn)一步描述），溶液中還含有2.5 mol m的2-（N-嗎啉基）乙磺酸（MES）3，pH值使用KOH調(diào)節(jié)至6.00。通過在1:1 v/v的N2和空氣中鼓泡（在調(diào)節(jié)溶解CO2之前），將培養(yǎng)基中的溶解O2濃度設(shè)置為空氣平衡的50%；這避免了測(cè)量過程中高O2的積聚。由于小瓶在加入葉子后立即在光下孵化，并且在光下產(chǎn)生O2，因此沒有組織缺氧的風(fēng)險(xiǎn)。通過向培養(yǎng)基中添加特定濃度的KHCO3，并根據(jù)添加的KHCO3使用不同量的KOH將pH值始終調(diào)整為6.00，施加溶解CO2處理，以提供30至2000 mmol m）3的CO2濃度范圍（Stumm&Morgan，1996）。在各種處理中根據(jù)需要添加硫酸鉀，以使各處理的鉀離子濃度相等。對(duì)于每種CO2濃度，沒有葉子的小瓶作為空白。

在已知持續(xù)時(shí)間（60–75分鐘）的培養(yǎng)后，使用連接到皮安計(jì)（PA2000；Unisense a?S）的克拉克型O2微電極（Revsbech，1989；OX-25；Unisense a?S，丹麥奧胡斯）測(cè)量小瓶中的溶解O2濃度。使用前立即校準(zhǔn)電極。

使用葉面積計(jì)（Li-3000；Li Cor，Lincoln，NE，USA）測(cè)量葉樣品的投影面積。投影面積使用根據(jù)葉片直徑和圓柱形葉片和錐形尖端的長(zhǎng)度測(cè)量面積所得的經(jīng)驗(yàn)關(guān)系轉(zhuǎn)換為實(shí)際表面積。實(shí)際面積與投影面積之比為3.633（n=10）。還測(cè)定了葉片樣品的新鮮和干燥質(zhì)量（冷凍干燥后）。實(shí)際葉面積與干物質(zhì)之比為17.54 g m）2（n=4）。

水下凈光合作用–O2響應(yīng)

使用與已描述的CO2響應(yīng)相同的系統(tǒng)測(cè)量葉片的水下凈光合作用；然而，初始O2濃度被控制，而不是CO2。初始O2濃度通過使容器中充滿N2或O2，然后根據(jù)需要將其混合來調(diào)整，以獲得所需的O2濃度?；旌虾螅瑢HCO3注入所有小瓶的培養(yǎng)基中，以在pH 6.00下獲得30 mmol CO2 m）3。與光合作用相關(guān)的表觀光呼吸增加明顯表現(xiàn)為凈O2產(chǎn)生速率下降，低于O2最佳時(shí)的最大速率。在一些樣本（即蘋果酸含量低的組織）中，由于光呼吸超過光合作用，出現(xiàn)了凈O2消耗（即光合作用產(chǎn)生的O2低于O2消耗）為了進(jìn)行比較，還測(cè)量了“暗呼吸”（見下文）。圖5顯示了培養(yǎng)期間小瓶中的平均O2濃度的凈光合作用速率，如用O2微電極測(cè)量的。

水下暗呼吸（Rd）

在黑暗條件下，使用與之前描述的CO2響應(yīng)相同的系統(tǒng)，但在熄燈的情況下，測(cè)量了葉片在水下的呼吸。通過將容器與N2或O2一起鼓泡，然后根據(jù)需要將其混合，以獲得半空氣平衡、空氣平衡和雙空氣平衡的所需O2濃度，來調(diào)整介質(zhì)的初始O2濃度?；旌虾?，注入KHCO3以在pH 6.00下獲得30 mmol CO2 m）3。使用四個(gè)葉尖，而不是水下凈光合作用實(shí)驗(yàn)中使用的兩個(gè)葉尖，以將培養(yǎng)時(shí)間保持在約2小時(shí)。在黑暗中測(cè)量小瓶中的凈O2攝取量，并記錄組織的投影面積和干質(zhì)量。

組織有機(jī)酸

黎明或黃昏時(shí)采集的葉片在液氮中冷凍，冷凍干燥，在球磨機(jī)中研磨，然后在冰涼的5%（v/v）高氯酸中提取（Fan等人，1993）。使用旋渦混合提取物，在12096 g下離心30分鐘，并收集上清液。在5%（v?v）高氯酸中第二次提取顆粒。使用K2CO3將兩種提取物的組合上清液的pH值調(diào)整為3.0–3.5，以沉淀高氯酸鹽。再次離心樣品，收集上清液，并測(cè)量體積。在高效液相色譜（HPLC）分析之前過濾提取物（0.22 lm）。

通過稍微調(diào)整Cawthray（2003）描述的方法，通過HPLC（600E泵，717plus自動(dòng)注射器，996光電二極管陣列檢測(cè)器；Waters，Milford，MA，USA）分析組織提取物中的有機(jī)酸。簡(jiǎn)言之，在22±0.5C的條件下，使用由25 mm KH2PO4組成的流動(dòng)相，在pH 2.50和1 ml min下，在Preval C-18色譜柱（內(nèi)徑250·4.6 mm，5-lm填料；Alltech Associates，Deerfield，IL，USA）1上實(shí)現(xiàn)分離。每五個(gè)樣品使用60%甲醇的梯度洗脫程序來沖洗更疏水的化合物柱，并消除夾帶物。檢測(cè)和定量在210 nm處進(jìn)行，光電二極管陣列（PDA）采集在195至400 nm之間，通過比較保留時(shí)間和PDA峰光譜分析（包括峰純度）標(biāo)準(zhǔn)品與未知物的峰純度，對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行陽性識(shí)別。根據(jù)峰面積與注入的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸質(zhì)量的關(guān)系，生成每種有機(jī)酸的校準(zhǔn)曲線。使用EMPOWER色譜軟件（Waters）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品（包括蘋果酸、異檸檬酸、丙二酸、莽草酸、乳酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、順烏頭酸和反烏頭酸）的保留時(shí)間和PDA光譜數(shù)據(jù)用于識(shí)別組織提取物中的有機(jī)酸。在HPLC之前，樣品的pH值<4.0，典型的樣品注射量范圍為20到100微升。在提取之前，將蘋果酸和檸檬酸添加到一些額外的澳洲一品紅葉片樣品中，驗(yàn)證了該方法；蘋果酸和檸檬酸的回收率分別為101±6和98±6（平均值±SE；n=4）。提供的數(shù)據(jù)未經(jīng)調(diào)整。

可滴定組織酸度

可滴定組織酸度的日變化（即組織勻漿的滴定）已被用作衡量夜間二氧化碳固定產(chǎn)生蘋果酸和白天蘋果酸脫羧引起的蘋果酸日變化的指標(biāo)（Lu–ttge，2004）。因此，除了組織有機(jī)酸外，我們還測(cè)量了可滴定的組織酸度，以便于與以前對(duì)水韭屬植物中CAM活性的研究進(jìn)行比較。

在黎明或黃昏取樣的葉片立即冷凍（）18C），并在取樣后1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分析。使用冰上的研缽和研杵使冷凍組織均質(zhì)，并在添加無二氧化碳去離子水（0.1 g組織FW在5 ml水中）后，將混合物轉(zhuǎn)移到玻璃瓶中，并按照Keeley&Sandquist（1991）的程序用0.01 N NaOH滴定至pH 6.40。