摘要

在本研究中，通過(guò)控制銅離子（Cu2+）濃度，可以顯著減少城市污水生物脫氮過(guò)程中氧化亞氮（N2O）的生成。首先，觀察到，當(dāng)在厭氧-好氧（低溶解氧）BNR工藝中處理合成廢水時(shí)，添加Cu2+（10–100μg/L）可減少54.5–73.2%的N2O生成，并提高總氮去除率。然后，研究了Cu2+的作用。亞硝酸鹽和氧化亞氮還原酶的活性隨著Cu2+的加入而增加，這加速了亞硝酸鹽向一氧化氮（NO2）的生物還原?→NO）和一氧化二氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)猓∟2O→N2）。定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)分析表明，添加Cu2+增加了N2O還原反硝化菌的數(shù)量。進(jìn)一步的研究表明，在添加Cu2+的系統(tǒng)中，更多的聚羥基烷酸酯被用于反硝化。最后，在處理實(shí)際城市廢水的另外兩種BNR工藝中，研究了通過(guò)控制Cu2+來(lái)減少N2O生成的可行性。由于城市污水中的Cu2+通常低于10μg/L，根據(jù)本研究，當(dāng)BNR系統(tǒng)中的污泥濃度約為3200 mg/L時(shí)，將進(jìn)水Cu2+補(bǔ)充到10–100μg/L有利于減少N2O排放并提高脫氮效果。

介紹

在許多國(guó)家，收集和處理的人類廢水?dāng)?shù)量正在增加，以維持和改善飲用水質(zhì)量，以及其他公共衛(wèi)生和環(huán)境保護(hù)效益。全世界都采用了經(jīng)濟(jì)高效的生物脫氮（BNR）技術(shù)來(lái)去除排入當(dāng)?shù)厮赖膹U水中的營(yíng)養(yǎng)物。然而，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)表明，BNR過(guò)程可促進(jìn)氧化亞氮（N2O）的生成，其變化范圍為氮負(fù)荷的0%至95%（Foley等人，2010年；Kampschreur等人，2008年；Meyer等人，2005年；Tallec等人，2006年；Zeng等人，2003年）。氧化亞氮（N2O）是一種有效的溫室氣體，其全球變暖潛力約為同等質(zhì)量二氧化碳的300倍（Houghton等人，2001年），是過(guò)去250年來(lái)輻射強(qiáng)迫的第四大貢獻(xiàn)者（Stehfest和Bouwman，2006年）。此外，N2O是平流層NOx的主要來(lái)源，因此有助于催化臭氧破壞。Ravishankara等人（2009年）發(fā)現(xiàn)，N2O的臭氧消耗潛力與氟氯烴相似，預(yù)計(jì)在整個(gè)二十一世紀(jì)將保持最大。大氣中的N2O濃度從18世紀(jì)的約276 ppbv（Machida等人，1995）增加到2005年左右的320 ppbv（美國(guó)環(huán)境保護(hù)局，2011），這被證明是人為原因（Leuenberger和Siegenthaler，1992）。因此，廢水處理過(guò)程中脫氮除磷過(guò)程中N2O的生成不容忽視，需要探索減少N2O生成的途徑。

據(jù)報(bào)道，BNR過(guò)程中產(chǎn)生和排放N2O的來(lái)源有兩種：自養(yǎng)硝化和異養(yǎng)反硝化。（1）硝化作用主要由將銨轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽的銨氧化細(xì)菌（AOB）和將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽的亞硝酸鹽氧化細(xì)菌進(jìn)行。當(dāng)亞硝酸鹽在環(huán)境中積累時(shí)，AOB可以轉(zhuǎn)變?yōu)榉聪趸?，最終產(chǎn)物主要是N2O而不是N2（Philips等人，2002年；Poth和Focht 1985年；Sliekers等人，2005年；Toyoda等人，2011年；Yang等人，2009年）。（2）由于N2O是異養(yǎng)反硝化的中間產(chǎn)物，不完全反硝化可能導(dǎo)致BNR過(guò)程中產(chǎn)生N2O（Otte等人，1996；Schalk-Otte等人，2000；Tallec等人，2008）。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局（2009年）關(guān)于廢水處理作業(yè)產(chǎn)生的N2O源和匯的最新報(bào)告表明，缺氧區(qū)的反硝化作用是活性污泥反應(yīng)器產(chǎn)生N2O的主要來(lái)源。還觀察到，反硝化過(guò)程中的N2O生成量為氮負(fù)荷的0.005–95%（Itokawa等人2001；Lemaire等人2006；Meyer等人2005；Tallec等人2008；Zeng等人2003），而硝化過(guò)程中的N2O生成量為氮負(fù)荷的0–16%（Burgess等人2002；Kampschreur等人2008；Tallec等人2006；Zheng和Hanaki 1994）。

迄今為止，文獻(xiàn)中已報(bào)告了幾種減少BNR中N2O生成的策略，例如增加缺氧時(shí)間或空氣補(bǔ)充，或應(yīng)用分步進(jìn)料序批式反應(yīng)器（SBR）（胡等人，2011年；Kimochi 1998年；楊等人，2009年）。然而，當(dāng)采用這些方法時(shí)，需要更大的反應(yīng)堆體積、更大的功耗和額外的控制裝置。也有報(bào)道稱，在間歇曝氣活性污泥工藝中添加固定化糞產(chǎn)堿桿菌（反硝化菌）可降低N2O排放。然而，需要培養(yǎng)和制備固定化糞腸球菌（Park等人，2007年）。

眾所周知，反硝化途徑中N2O的還原是由一種覆銅蛋白——氧化亞氮還原酶（N2OR）催化的。通過(guò)低溫、高亞硝酸鹽、氧氣、H2S、低化學(xué)需氧量（COD/N）和固體保留時(shí)間（SRT）等抑制N2OR活性，將導(dǎo)致N2O累積（Hanaki等人1992；Itokawa等人2001；M?rkved等人2006；Noda等人2003；Otte等人1996；Schonharting等人1998；Zhou等人2008）。Granger和Ward（2003）指出，與鐵等其他金屬相比，銅是提高純反硝化菌N2OR活性的重要元素，導(dǎo)致反硝化過(guò)程中N2O積累顯著減少。Manconi等人（2006）觀察到，向反硝化污泥系統(tǒng)中添加銅可以消除H2S對(duì)N2OR的抑制作用。雖然銅是影響反硝化的一個(gè)已知因素，但銅對(duì)BNR工藝中減少N2O生成的影響尚未記錄。

本研究的目的是研究在厭氧-好氧（DO濃度0.15–0.5 mg/L）BNR過(guò)程中，Cu2+對(duì)N2O還原和養(yǎng)分去除的影響。從代謝中間產(chǎn)物、反硝化酶和反硝化菌群落三個(gè)方面研究了添加Cu2+減少N2O生成的機(jī)理。最后，在另外兩種BNR工藝中，研究了通過(guò)將Cu2+濃度控制在10–100μg/L來(lái)減少城市污水生物處理過(guò)程中N2O生成的方法。

材料和方法

合成廢水

厭氧-低溶解氧BNR工藝中使用的合成廢水每天制備，其中包含（每升）2.5 mL溶液A、2 mL溶液B、1 mL營(yíng)養(yǎng)液、0.5 mL濃縮蛋白胨液和一定量的乙酸。溶液A含有（每升）10 g MgSO4?7H2O，4.5 g CaCl2?H2O和93.6 g NH4Cl。溶液B含有（每升）29 g KH2PO4和33 g K2HPO4。濃縮蛋白胨液每升含有200克蛋白胨。營(yíng)養(yǎng)液中含有（每升）1.5 g FeCl3?6H2O，0.15 g H3BO3，0.03 g CuSO4?5H2O，0.18克碘化鉀，0.12克氯化錳?4H2O，0.06 g Na2Mo4?2H2O，0.12克硫酸鋅?7H2O，0.15 g氯化鈷?6H2O和10 g乙二胺四乙酸。用4 M HCl或4 M NaOH將合成廢水的初始pH調(diào)節(jié)至pH 7.4±0.2。

城市廢水

它是從中國(guó)上海一污水處理廠的初沉池出口獲得的。其主要特征如下：總COD 176–209 mg COD/L，可溶性COD（SCOD）140–170 mg/L，乙酸15–31 mg COD/L，氨（NH4+-N）19–30 mg/L，總氮（TN）28–38 mg/L，可溶性正磷酸鹽（SOP）2.8–4.8 mg/L，總磷酸鹽（TP）3.0–5.5 mg/L，pH 7.4–7.6。用溶液A和溶液B（如上所述）補(bǔ)充城市廢水，得到平均初始NH4+-N和SOP分別為30和12 mg/L。通過(guò)添加乙酸，反應(yīng)器中的初始SCOD保持在約350 mg/L。用4 M HCl或4 M NaOH將城市廢水的初始pH值調(diào)整為pH 7.4±0.2。

Cu2+懸浮液的制備

本研究中使用了市售銅粉（Sigma），通過(guò)配備旋轉(zhuǎn)陽(yáng)極和Cu-KR輻射源的Rigaku D/Max RB衍射儀進(jìn)行X射線衍射分析，確認(rèn)其為純銅（電子補(bǔ)充材料，圖S7）。為了制備1 g/L的Cu2+漿料懸浮液，將1.000 g銅粉（99.9%）分散到20 mL（1+1）硝酸中。將懸浮液加熱至銅粉溶解。然后添加10毫升（1+1）硫酸并加熱。冷卻后，將懸浮液充分混合在970 mL Milli-Q水中。

圖1不同Cu2+濃度下需氧階段N2O排放率（氣相）的比較

Cu2+對(duì)合成廢水厭氧-低溶解氧BNR過(guò)程中N2O生成的影響

六個(gè)厭氧-好氧序批式反應(yīng)器（ALDSBR）每天運(yùn)行三個(gè)周期，每個(gè)反應(yīng)器的工作體積為4 L。每個(gè)循環(huán)8小時(shí)（2小時(shí)厭氧，3小時(shí)需氧，1小時(shí)沉淀，10分鐘傾析，110分鐘空閑）。種子污泥從中國(guó)上海市污水處理廠的二沉池中提取。該工廠采用BNR運(yùn)行。在厭氧階段的最初10分鐘內(nèi)，將合成廢水（2 L）泵入每個(gè)反應(yīng)器。在低溶解氧階段，使用帶在線溶解氧檢測(cè)器的開(kāi)/關(guān)控制系統(tǒng)間歇性提供空氣，以將溶解氧水平保持在0.15至0.5 mg/L之間。在低溶解氧階段結(jié)束前10分鐘，浪費(fèi)污泥，以將SRT維持在約20天。沉淀后，從每個(gè)SBR中去除2 L上清液，產(chǎn)生16小時(shí)的水力停留時(shí)間。除沉淀、傾析和閑置期間外，反應(yīng)器始終與磁力攪拌器混合。在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)（即從第1天到第20天），這六個(gè)SBR中的COD、NH4+-N和SOP濃度分別控制在200、20和8 mg/L，然后從第21天到第40天逐漸增加到350、30和12 mg/L，并最終保持在這些濃度。培養(yǎng)126天后，觀察到所有反應(yīng)器中的氮和磷去除率均未隨時(shí)間發(fā)生顯著變化，然后將Cu2+添加到反應(yīng)器#1#5中，使其濃度分別為10、50、100、1000和5000μg/L。反應(yīng)器#6作為對(duì)照，不添加額外的Cu2+。所有反應(yīng)器均采用上述相同的厭氧-好氧配置運(yùn)行。在所有SBR中氮磷去除和N2O生成相對(duì)穩(wěn)定之前需要125天，然后報(bào)告數(shù)據(jù)。

在其他BNR工藝中通過(guò)控制城市污水處理過(guò)程中的Cu2+濃度來(lái)減少N2O生成的檢驗(yàn)

運(yùn)行了三個(gè)厭氧-好氧-缺氧SBR（AAA-SBR）和三個(gè)多厭氧（缺氧）-好氧SBR（MAAA-SBR），分別通過(guò)將Cu2+濃度控制在10和100μg/L來(lái)研究減少城市污水生物處理中N2O生成的可行性。從上述ALD-SBR#6中提取種子污泥。這六種SBR中的兩種，一種AAA-SBR和一種MAAA-SBR，不添加Cu2+，被設(shè)置為對(duì)照。所有SBR（每個(gè)SBR的工作體積為4.0升）每天運(yùn)行三個(gè)周期（每個(gè)8小時(shí)）。厭氧-好氧-缺氧過(guò)程的每個(gè)循環(huán)包括2小時(shí)厭氧、2小時(shí)好氧、1小時(shí)缺氧、1小時(shí)沉淀、10分鐘傾析和110分鐘閑置。多厭氧（缺氧）-好氧過(guò)程的配置為100分鐘厭氧、60分鐘需氧、45分鐘缺氧、30分鐘需氧、45分鐘缺氧、30分鐘需氧、45分鐘缺氧和15分鐘需氧周期，然后是70分鐘沉降、10分鐘傾析和30分鐘空閑階段。沉淀期結(jié)束后，排出2.0升上清液，并在接下來(lái)的最初10分鐘厭氧時(shí)間內(nèi)用2.0升新鮮城市廢水進(jìn)行替換。這六個(gè)SBR保持在21±1°C，并通過(guò)在最終好氧階段結(jié)束前浪費(fèi)污泥，將SRT控制在約20天。在活性污泥培養(yǎng)過(guò)程中，COD、NH4+和SOP的濃度分別保持在350、30和12 mg/L。直到在所有反應(yīng)器中觀察到穩(wěn)定的氮和磷去除，才報(bào)告數(shù)據(jù)。

分析方法

COD、NH4+-N、NO3的分析?-N、NO2號(hào)?-N、TN、SOP、TP、混合液體懸浮固體（MLSS）和混合液體揮發(fā)性懸浮固體（MLVSS）按照標(biāo)準(zhǔn)方法（美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)1998）進(jìn)行。根據(jù)報(bào)告的方法測(cè)量糖原、聚羥基烷酸鹽（PHA）（包括聚羥基戊酸鹽、聚羥基丁酸鹽（PHB）和聚羥基-2-甲基戊酸鹽（PH2MV））（姜等人，2009）。使用微型傳感器（丹麥Unisense）測(cè)量氣相和液相中的N2O濃度，并根據(jù)報(bào)告的方法計(jì)算N2O排放率（Kampschreur等人，2008）。通過(guò)消耗電子受體（NO3）來(lái)測(cè)量硝酸鹽、亞硝酸鹽、一氧化氮和氧化亞氮還原酶的活性?,NO2號(hào)?,NO和N2O），芐基紫精作為合成電子供體（Krijansson和Hollocher 1980）。銅離子通過(guò)ICP-MS（安捷倫科技7700系列）檢測(cè)。

定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）如下所示。nosZ基因的引物分別為5′cGcracGcAAsgaaggtsmssgt3′和5′CAKRTG CAKSGCRTGGCAGAA3′，分別稱為nosZ2F和nosZ2R（Henry等人，2006）。5′ACCGCCGCCAA CAACTCCAAC3′和5′CCGCTGGCTTGAGC3′，分別稱為nirSsh2F和nirSsh4R，被用作nirS基因的引物（Henderson等人，2010）。nirK基因的引物為nirK876和nirK1040，其序列分別為5′atyggggvayggga3′和5′gcctcgatcagrttgt3′（Henry等人，2004）。它們的標(biāo)準(zhǔn)曲線（電子補(bǔ)充材料，圖S1、S2和S3）是使用分別含有nosZ、nirS和nirK序列的線性化質(zhì)粒的10倍連續(xù)稀釋的三個(gè)重復(fù)序列作為模板，在上述文獻(xiàn)中描述的循環(huán)條件下生成的。通過(guò)觀察單個(gè)熔融峰（電子補(bǔ)充材料，圖S4、S5和S6）來(lái)檢查擴(kuò)增產(chǎn)物的純度。使用從活性污泥中提取的基因組DNA，使用上述引物擴(kuò)增nosZ、nirS和nirK基因片段，并在20μL體積中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析，其中包含1μL 20×SYBR綠色PCR主混合物（SYBR（R）綠色I(xiàn)核酸a，Invitrogen），每個(gè)引物0.5μM，和1μL模板DNA。引物的熱循環(huán)條件符合上述文獻(xiàn)。然后，克隆nosZ、nirS和nirK基因片段，并通過(guò)測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)提取質(zhì)粒的濃度和大小（堿基對(duì)）計(jì)算含有nosZ、nirS和nirK的質(zhì)粒的拷貝數(shù)。分別對(duì)活性污泥中的nosZ、nirS和nirK基因進(jìn)行了獨(dú)立的定量PCR分析。對(duì)每個(gè)定量PCR分析運(yùn)行兩個(gè)無(wú)模板對(duì)照。

表1 Cu2+對(duì)厭氧-低溶解氧BNR工藝處理的合成廢水中N2O生成和NH4+-N、TN和TP去除的影響

結(jié)果

Cu2+對(duì)厭氧-好氧（低DO）BNR工藝處理合成廢水過(guò)程中N2O生成和N、P去除的影響

據(jù)報(bào)道，一些氮被還原為N2O，而不是N2，從而在需氧期產(chǎn)生短暫的N2O累積。圖1顯示了六個(gè)SBR中有氧（低DO）期間N2O排放率的變化。SBR循環(huán)期間，生物反應(yīng)器（#1–#4，#6）的N2O排放呈現(xiàn)出一種規(guī)律：N2O的排放速率在需氧期的前2.5小時(shí)增加，然后下降。

當(dāng)Cu2+濃度為10μg/L和100μg/L時(shí)，N2O的最高排放速率分別為0.19和0.14μmol/min。與SBR對(duì)照（0.45μmol/min）相比，N2O排放率分別降低了58%和68%，表明在低劑量Cu2+添加（10–100μg/L）下，N2O排放量可以顯著減少。然而，當(dāng)Cu2+濃度為5000μg/L時(shí)，觀察到N2O的釋放量較高，這表明Cu2+的劑量超過(guò)了適當(dāng)?shù)南拗啤Ｔ趨捬跗陂g沒(méi)有檢測(cè)到N2O生成（數(shù)據(jù)未顯示）。

在本研究中，還測(cè)量了液體中的N2O生成量，并量化了總N2O（液相和氣相）。如表1所示，未添加Cu2+的反應(yīng)器（即對(duì)照反應(yīng)器）中的總N2O生成量為0.431 mg N2O-N/mg N。當(dāng)Cu2+濃度為10μg/L時(shí)，N2O的生成量為0.196 mg N2O-N/mg N，當(dāng)Cu2+濃度為100μg/L時(shí)，N2O的生成量進(jìn)一步降低到0.119 mg N2O-N/mg N。然而，當(dāng)Cu2+濃度增加到1000μg/L時(shí)，生成的N2O變?yōu)?.202 mg N2O-N/mg N。與對(duì)照組相比，進(jìn)一步將Cu2+增加到5000μg/L會(huì)導(dǎo)致更高的N2O生成量（去除0.520 mg N2O-N/mg N）。因此，與對(duì)照相比，通過(guò)將廢水Cu2+濃度控制在10至100μg/L，可以減少54.4%至72.4%的N2O生成。

表1還顯示了Cu2+對(duì)NH4+-N、TN和TP去除的影響。當(dāng)Cu2+濃度在10～100μg/L范圍內(nèi)時(shí)，氨氮和總磷的去除率與對(duì)照組幾乎相同。然而，添加Cu2+對(duì)TN的去除有影響。對(duì)照組的TN去除率為60.6%，在10μg/L的Cu2+存在下增加到69%（p<0.05）。當(dāng)Cu2+濃度在10到100μg/L之間時(shí)，TN去除率保持在70%左右。從表1還可以看出，NH4+-N和TN的去除率分別顯著降低到74.3%和36.3%，當(dāng)Cu2+濃度增加到5000μg/L時(shí)，沒(méi)有凈磷去除。

圖2添加100μg/L Cu2+對(duì)NH4+-N和NO3變化的影響?-N（a）、硫酸鉀和二氧化氮?-N（b）在一個(gè)厭氧-低溶解氧循環(huán)中。誤差條表示三種不同測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差