隨著高通量測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展，人們對(duì)微生物的認(rèn)知也在逐漸深入。凌恩生物每天都會(huì)接到全國(guó)各類型微生物測(cè)序樣本，上到山巔土壤，下至深海底泥；有老師研究植物根際和葉內(nèi)微生物，也有老師關(guān)注動(dòng)物昆蟲腸道生理代謝的奧秘。為了得到能夠研究的測(cè)序結(jié)果，規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的取樣及送樣是成功的前提。

在樣本送測(cè)前，我們要注意以下幾點(diǎn)：

1、取樣使用的工具及容器必須經(jīng)過滅菌處理；

2、取樣后及時(shí)做好標(biāo)記，記錄取樣相關(guān)信息；

3、樣本送測(cè)前做好備份，防止意外發(fā)生丟失珍貴樣本；

4、送測(cè)樣本使用標(biāo)準(zhǔn)容器承裝，在容器上標(biāo)記清晰，送樣不宜過多；

5、寄送時(shí)保持低溫環(huán)境，建議使用干冰配送；

6、可使用凌恩微生態(tài)樣本保真液，高品質(zhì)樣本是決定高品質(zhì)研究成果的第一步。

常規(guī)土壤類樣本取樣方法-農(nóng)田/森林/草原土壤等

(1)取樣方法

按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定采樣范圍，取樣器具需事先消毒滅菌處理。采樣時(shí)應(yīng)去除地表雜質(zhì)，根據(jù)需要挖取相應(yīng)深度（如5~20 cm）的土壤，置于冰上運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。去除可見雜質(zhì)，建議過2 mm無菌篩網(wǎng)。同一樣方多點(diǎn)樣本等量混合均勻后取5~10 g，保存無菌EP管中，進(jìn)行核酸提取，或-80℃保存?zhèn)溆?。若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司?

注：建議戴一次性手套、口罩，進(jìn)行嚴(yán)格取樣和操作，盡可能減少人為的污染。

根際土壤樣本取樣方法-作物/蔬菜/草木根系等

（1）作物類（含草地等矮小植物）根際土壤取樣方法

a.采集植物植株，去除根部大塊土壤，置于冰上運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室；

b.晃動(dòng)根部，去除根部松散的土壤后，使用無菌刷子從根部收集殘留土壤；

c.同一樣方多點(diǎn)取樣土壤樣本等量混合均勻后，液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。

（2）林木類根際土壤取樣方法

a.采集地面下10-20 cm根際土壤，置于冰上運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室；

b.過2-5 mm孔徑無菌篩網(wǎng)；

c.同一樣方多點(diǎn)取樣土壤樣本等量混合均勻后，液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。

若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司提取。

注：取樣器具請(qǐng)事先消毒滅菌處理。若為真菌根際土壤，請(qǐng)務(wù)必盡可能去除菌絲體殘留，減少對(duì)DNA/RNA提取的干擾。

植物表面微生物取樣方法?

（1）取樣方法

依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行樣方設(shè)置，每一樣方進(jìn)行多點(diǎn)取樣，同一樣方點(diǎn)等量混勻成一個(gè)樣本。植物根部組織可以通過搖晃振蕩或無菌刷子去除根表粘附土壤。

（2）樣本前處理

將植物組織浸沒于無菌PBS溶液，180rpm孵育20min；取出植物組織，再次加入無菌PBS溶液，180rpm孵育20min，取出植物組織，再次加入無菌PBS溶液，超聲波洗滌10min（參數(shù)：160 W，30s/30s），最后取出植物組織至于-80度冰箱保存?zhèn)溆谩?

將三次洗滌液匯總，過0.2um濾膜（或12000g離心10min，收集沉淀），收集濾膜至于-80度冰箱保存。

植物內(nèi)部微生物取樣方法

（1）依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行樣方設(shè)置，每一樣方進(jìn)行多點(diǎn)取樣，同一樣方點(diǎn)等量混勻成一個(gè)樣本。

（2）對(duì)植物組織進(jìn)行表面消毒操作或者使用上一步“植物表面微生物取樣”中處理過的植物組織，液氮速凍后，研磨成粉，即可用來進(jìn)行核酸的提取。

植物組織表面消毒具體操作如下：

無菌水洗滌30s，70%無菌乙醇洗滌2min，2,5%NaClO（含0.1%Tween 80）浸泡5min后轉(zhuǎn)移至70%無菌乙醇浸泡30s，最后使用無菌水洗滌植物組織3次，即視為對(duì)植物組織表面進(jìn)行無菌化。

表面無菌化的植物組織至于-80度冰箱保存?zhèn)溆没蜻M(jìn)行核酸提取。

植物根表面微生物取樣方法

（1）將所研究的物體放在事先滅好的無菌容器當(dāng)中；

（2）加入PBS緩沖液后進(jìn)行振蕩，使得微生物從物體表面充分的脫落并聚集在PBS緩沖液當(dāng)中,震蕩至少2h以上；

（3）直接提取PBS緩沖液中的微生物或者將緩沖液用濾膜過濾之后再進(jìn)行DNA的提取。

PBS濃度和PH有要求：濃度是用1x的，PH值是7.4，一般買回來的PBS是10x的，建議稀釋到1x。

注意：建議優(yōu)先使用超聲波洗滌。

空氣樣本微生物取樣方法

使用空氣抽濾機(jī)，使空氣通過0.22μm濾膜，濾膜上有可見覆蓋物（過濾時(shí)間越長(zhǎng)，收集的空氣中的灰塵越多，菌數(shù)量越多），收集完成后取下濾膜。濾膜置于凍存管中，液氮速凍，干冰寄送到實(shí)驗(yàn)室。

注意：由于樣本特殊，微生物含量較少，建議多保管備份保存。

水體樣本微生物取樣方法

送樣量：擴(kuò)增子直徑3-4cm濾膜1-2張；宏基因組直徑3-4cm濾膜>=2張；

（1）研究目的進(jìn)行確定水體的取樣深度和范圍；

（2）采樣后進(jìn)行濾膜過濾，選擇合適孔徑的濾膜，對(duì)于澄清水體或者略渾濁水體，選用0.22μm或者0.45μm的濾膜，取樣體積大于5L；對(duì)于渾濁水體，建議先用大孔徑的濾膜過濾一遍，再用小孔徑的濾膜過濾；

（3）水體泥樣的采集提供大于5g樣本；

（4）用大體積干冰運(yùn)輸，且要保證我方在收到樣品開箱檢驗(yàn)時(shí)有足夠的干冰剩余。

注意：擴(kuò)增子項(xiàng)目將2-3L水體過濾到1-2張濾膜（0.22或0.45um）后裝入到離心管中；宏基因組項(xiàng)目將10L水體過濾到>=2張濾膜（0.22或0.45um）后裝入到離心管中。

活性污泥與水體/地表沉積物類樣本取樣方法

（1）活性污泥

從活性污泥裝置中取大于10 ml的懸浮污泥樣本（約5-10 g沉降物），保存無菌EP管中，放入液氮或置于冰上，立即運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核酸提取，或-80℃保存?zhèn)溆谩?

注：若液態(tài)污泥樣本沉降物較少，可適當(dāng)增加取樣量。

（2）水體/地表沉積物

取距離水底/地表0-10 cm（具體按實(shí)驗(yàn)需要而定）的沉積物5~10 g，保存無菌取樣袋或EP管中，置于冰上運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核酸提取，或-80℃保存?zhèn)溆?。若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司提取?