摘要

據(jù)報道，昆蟲腸道微環(huán)境中的物理化學(xué)條件在食物加工和代謝中起著重要作用。在這項研究中，用微電極系統(tǒng)研究了真菌生長白蟻——臺灣白蟻的離體腸道中的氧、pH、氧化還原電位和氫的分布。與其他白蟻相比，臺灣白蟻腸道系統(tǒng)的氧分壓相對較低，范圍為0至8.6 kPa。除直腸區(qū)域外，不同腸道區(qū)域的pH值為中性（pH值6.1–7.4）。每個腸道區(qū)域（直腸除外）中心的平均氧化還原電位較高，范圍約為+70至+310 mV。特別是，作為木質(zhì)纖維素降解過程中的中心中間體，后腸腹中的氫分壓高達(dá)10.4 kPa。此外，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）評估了白蟻腸道系統(tǒng)、巢穴共生真菌梳以及巢穴土壤樣本中的13種金屬離子濃度，這表明，在主要消化道區(qū)域記錄的13種離子中，有6種金屬離子（K、Mg、Mn、Ba、Se和Mo）在空間分布上存在顯著差異。在直腸、真菌梳子和巢穴土壤樣本中也觀察到一些金屬離子顯著富集。較低的氧氣濃度、中性pH值、較高的氧化還原電位和較高的氫積累，以及臺灣褐飛虱消化道中金屬離子的特征性空間分布，突出了真菌生長白蟻在其腸道微環(huán)境中最重要的獨特性，提示腸道生態(tài)系統(tǒng)的獨特結(jié)構(gòu)和功能可能存在于腸道內(nèi)。

1.介紹

許多昆蟲腸道系統(tǒng)的物理化學(xué)條件已在文獻(xiàn)中得到充分記錄（Gross等人，2008年；Johnson和Barbehenn，2000年；Lemke等人，2003年）。還報告了一些關(guān)于食木白蟻和食土白蟻腸道分隔系統(tǒng)的獨特研究，并對其氧、氫、pH和氧化還原電位的軸向和徑向動態(tài)進(jìn)行了原位表征（Brune等人，1995a；Ebert和Brune，1997；Kappler和Brune，2002）。根據(jù)所報道的這些物理化學(xué)參數(shù)，我們提出了一些基本代謝過程的機(jī)制以及白蟻腸道中的食物消化，并將其應(yīng)用于進(jìn)一步了解食物消化，腸道共生微生物結(jié)構(gòu)及其在這些白蟻腸道環(huán)境中的相應(yīng)功能（Brune等人，1995b；Kappler和Brune，1999；Pester和Brune，2007；Schmitt Wagner和Brune，1999）。這些研究確實有助于深入了解腸道物理化學(xué)環(huán)境及其在腸道代謝中的關(guān)鍵功能之間的關(guān)系，如木材消化過程（Ke等人，2010）。

此外，腸道系統(tǒng)中的金屬離子對取食木材的昆蟲可能很重要，這不僅是因為已經(jīng)進(jìn)化出多種酶，需要與某些金屬結(jié)合，以便它們的催化活性在許多生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如白蟻的產(chǎn)氫、呼吸和碳水化合物水解，但也涉及腸道微生物群中碳和電子流動的途徑（Vu等人，2004年；Ballo和Leadbetter，2011年）。白蟻腸道系統(tǒng)中的幾種木質(zhì)纖維素酶已被證明是金屬依賴性酶，包括食木白蟻黃鰭網(wǎng)紋白蟻前腸中的銅結(jié)合漆酶（Coy等人，2010年），以及真菌生長白蟻安南代大白蟻后腸中的鎂依賴性木聚糖酶（Liu等人，2011年）。因此，更好地描述腸道微環(huán)境中的金屬離子分布可能有助于了解白蟻如何利用各種生物催化劑有效消化腸道系統(tǒng)中的木材基質(zhì)，以及有助于為未培養(yǎng)的腸道微生物群設(shè)計更有效的培養(yǎng)基的潛在價值。

然而，迄今為止，關(guān)于真菌生長白蟻腸道內(nèi)的物理化學(xué)條件和金屬離子分布的信息仍然有限且罕見。作為高等白蟻的一個單系譜系（它們的后腸通常沒有原生共生體，Bignell和Eggleton，1995年），真菌生長的白蟻通常在熱帶和亞熱帶地區(qū)大量存在，尤其是在亞洲和非洲，數(shù)百萬年來，它們一直是地球上木質(zhì)纖維素循環(huán)利用中最重要的分解者之一（Nobre et al.，2011）。這種以木材為食的白蟻可以在其巢穴中獨特地培養(yǎng)一種共生真菌，即白蟻菌屬（Aanen，2006），它有效地幫助白蟻宿主降解難降解的木質(zhì)纖維材料，尤其是木質(zhì)素對應(yīng)物，同時也提高了它們腸道中全纖維素的消化率（Hyodo等人，2000年；Zhou等人，2010年）。因此，與其他類型的白蟻不同，這些真菌生長的白蟻呈現(xiàn)出一種獨特的消化系統(tǒng)，與各種微生物共生體相關(guān)，從它們的腸道系統(tǒng)，也從它們的巢穴。由于這種特殊的聯(lián)系，真菌生長白蟻的腸道系統(tǒng)具有獨特的形態(tài)結(jié)構(gòu)，與其他高等白蟻不同?；旌隙蔚娜狈屠L且高度分隔的后腸表明，它們可能同時發(fā)展出不同的物理化學(xué)環(huán)境，以應(yīng)對食物加工和相關(guān)代謝（Anklin-Mühlemann等人，1995年）。因此，了解真菌生長白蟻的腸道理化條件和相關(guān)的金屬離子分布對于它們高效的食物消化功能非常重要。

目前，對真菌生長白蟻腸道pH值和氧化還原電位的大多數(shù)研究都是通過收集主要腸道段的樣本和使用pH敏感紙進(jìn)行觀察來進(jìn)行的（Anklin-Mühlemann等人，1995年；Bignell和Eggleton，1995年）。然而，通過這種方法獲得的數(shù)據(jù)可能無法代表真菌生長白蟻的分化腸道系統(tǒng)的實際原位微環(huán)境，因此無法預(yù)測可能的食品加工模式（Brune和Kühl，1996；Ke等人，2010）。

在這項研究中，微電極技術(shù)被用于測量真菌生長白蟻物種臺灣白蟻的腸道主要隔室的軸向和徑向pH、氧、氧化還原電位和氫。此外，還使用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）測定了腸道系統(tǒng)不同區(qū)域內(nèi)的金屬離子分布。

2.材料和方法

2.1.昆蟲

2011年7月，在中華人民共和國浙江省諸暨市的田野中收集了一窩含有活性白蟻和真菌梳的臺灣白蟻。在實驗室中，在25±1℃和>69%相對濕度的恒定溫度下，在完全黑暗的環(huán)境中使用前，菌落保持不超過一周。從群體中隨機(jī)選擇工蟻，并用于所有測量。圖1顯示了臺灣白蟻工蟻的獨特形態(tài)以及隔離腸道中的主要隔室。

圖1。 臺灣白蟻工蟻離體腸道系統(tǒng)的形態(tài)特征。 圖中顯示的主要腸道腔室包括前腸（FG）、中腸（MG）、大腹便便（Pa）、結(jié)腸（Co）和直腸（Re），其中大腹便便、結(jié)腸以及直腸被歸類為白蟻消化道系統(tǒng)中的后腸。

2.2.微電極

氧微傳感器（OX-25）和氧化還原電位電極（RD-25）的尖端直徑約為25 lm。氫微傳感器（H2-10）的尖端直徑約為10 lm，pH電極（pH-10）的尖端直徑為10-20 lm，敏感尖端長度為100-150 lm。在pH和氧化還原電位測量期間，使用Ag-AgCl參比電極（REF-25），并通過填充KCl的瓊脂糖橋鑄入PTFE管連接到測量室（Brune和Kühl，1996）。本實驗中使用的所有微傳感器及相關(guān)放大器均從Unisense（丹麥奧胡斯）購買。

在使用該系統(tǒng)測量氧氣之前，將氧氣電極預(yù)極化至少2小時，并用抗壞血酸鈉溶液（0.1 M最終濃度）和起泡的Milli-Q水（>5分鐘起泡）校準(zhǔn)。用鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液和硼酸鹽緩沖液（pH分別為4和9）校準(zhǔn)pH電極。用氫醌氧化還原緩沖溶液（每升緩沖溶液中10克氫醌，pH值4或7）校準(zhǔn)氧化還原電極。最后，將氫電極預(yù)極化至少1小時，直到傳感器信號穩(wěn)定，然后用Milli-Q水和用氫氣沖洗的Milli-Q水進(jìn)行校準(zhǔn)（>5分鐘起泡）。上述所有化學(xué)品均從國藥集團(tuán)化學(xué)試劑中國（中國上海）訂購。

2.3.微電極測量

對于氧氣、pH值、氧化還原電位和氫氣測量，按照Brune等人（1995a）的描述，用一個微載玻片和四個微蓋玻片制作了一個微室。將一層4–5 mm厚的瓊脂糖（由昆蟲林格溶液中的1.5%瓊脂糖組成）填充到每個微室中。在瓊脂糖層表面以拉長和拉伸的方式分離完整的臺灣白蟻工蟻腸道，然后在測量之前在腸道樣本上快速涂上一薄層瓊脂糖（40℃）。

使用手動微操作器（丹麥奧胡斯Unisense）定位微傳感器，使用水平安裝的顯微鏡（中國江南）目視控制尖端位置和腸道位置，瓊脂糖在載玻片上凝固后，立即用微電極系統(tǒng)對白蟻腸道進(jìn)行測量。在25±1℃的常規(guī)空調(diào)條件下，用微電極的外端在臺灣褐飛虱腸道系統(tǒng)的五個主要腔室（包括前腸、中腸、腹部、結(jié)腸和直腸）的不同點從腸壁開始測量動作。

2.4.金屬離子分析

隨機(jī)抽取10只臺灣白蟻，分別解剖出每一個腸道系統(tǒng)。用Milli-Q水分別沖洗每個白蟻工人腸道系統(tǒng)中的前腸、中腸、大腹便便/結(jié)腸和直腸內(nèi)容物，并立即將其轉(zhuǎn)移到1.5 ml滅菌管中，其中含有500 ll Milli-Q水。此后，在80℃下用5mL HNO3消化每個腸道部分的洗滌內(nèi)容物管1小時，然后在160℃下在塊狀加熱器中蒸發(fā)1.5小時，去除HNO3。最后，蒸發(fā)后約0.5 ml的消化樣品在分析前用10 ml Milli-Q水稀釋。

從臺灣白蟻巢穴采集的土壤樣本和真菌梳經(jīng)風(fēng)干后磨成細(xì)粉（<2mm）。接地的土壤和梳狀樣品（0.2 g）在120℃下用微波3000（Anton Paar，奧地利）和6 ml HNO3進(jìn)一步進(jìn)行微波消解10 min，然后在190℃下進(jìn)行20 min，然后在160℃下轉(zhuǎn)移到塊狀加熱器中超過1 h，直到溶液變?yōu)闊o色，旨在去除樣品中的HNO3和潛在有機(jī)物含量。在分析之前，用20 ml Milli-Q水稀釋剩余的消化樣品（約1 ml）。

通過ICP-MS（安捷倫7500A）和八極反應(yīng)系統(tǒng)（ORS）（日本橫河分析系統(tǒng)公司）分析從每個隔間的白蟻腸道系統(tǒng)或共生真菌梳制備的消化樣品，以及白蟻巢穴的土壤中的金屬離子分布。ICPMS測量的每個樣品的剖面總共包括13種不同的金屬離子（K、Mg、Fe、Zn、Cu、Mn、Ni、Al、Ba、Se、Mo、Ca和Na），因為在白蟻腸道系統(tǒng)和它們巢穴中的共生真菌中，參與木質(zhì)纖維素消化和腸道必需代謝的一些相關(guān)酶，可能與這些金屬離子有關(guān)。所有校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液均通過在2%（v/v）HNO3中適當(dāng)稀釋1000 mg/L多元素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（安捷倫，美國加利福尼亞州帕洛阿爾托）制備。此外，從安捷倫（美國加利福尼亞州帕洛阿爾托安捷倫）購買的10 lg/L銦用作內(nèi)標(biāo)，并添加到所有樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和空白中。ICP-MS的工作條件如下：射頻功率1250W；等離子體氣體流速，15升/分鐘；載氣流速，1.06升/分鐘；霧化器泵，0.1轉(zhuǎn)/秒。

為了計算不同腸道隔室中的金屬離子濃度，根據(jù)其幾何形狀估計腸道部分（前腸、中腸、大肚結(jié)腸和直腸）的體積（Anklin-Mühlemann等人，1995年）。因此，每個腸道部分的金屬離子濃度最終報告為單位體積內(nèi)金屬離子相對于腸道部分的摩爾重量（mM）。另一方面，巢穴真菌梳和土壤樣本的金屬濃度報告為單位水體積中金屬離子的摩爾重量，單位樣品重量（mM）。本次調(diào)查中的每項測量和觀察重復(fù)四次。

2.5.統(tǒng)計分析采用單因素方差分析和Bonferroni多重比較試驗（a=0.05），對臺灣褐飛虱腸道室效應(yīng)和腸道室（前腸、中腸、腹部/結(jié)腸）中檢測到的金屬濃度的差異進(jìn)行分析。積聚在白蟻腸道系統(tǒng)直腸區(qū)域的金屬離子將主要排出，隨后作為外共生真菌梳子的基質(zhì)。因此，大多數(shù)積聚在直腸中的金屬離子與真菌梳子以及白蟻巢穴中的土壤樣品中的金屬輪廓顯著正相關(guān)。因此，將直腸的數(shù)據(jù)與巢穴真菌梳子和土壤樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，以進(jìn)行金屬離子富集效應(yīng)的方差分析。使用軟件R版本2.13.0（www.R-project.org）進(jìn)行所有數(shù)據(jù)分析。