石墨烯因其獨(dú)特的電學(xué)特性，是碳基生物傳感器（如微電極和場(chǎng)效應(yīng)晶體管）的有前景的候選材料。最近，石墨烯生物傳感器已成功用于電生細(xì)胞的細(xì)胞外動(dòng)作電位記錄；然而，由于缺乏有效的細(xì)胞穿孔方法，細(xì)胞內(nèi)記錄仍超出其當(dāng)前能力范圍。在此，我們展示了一種由垂直生長的三維模糊石墨烯（3DFG）構(gòu)成的微電極平臺(tái)，能夠以高信噪比記錄細(xì)胞內(nèi)的心臟動(dòng)作電位。我們利用超快脈沖激光產(chǎn)生的熱載流子來穿孔細(xì)胞膜，并在3DFG電極與細(xì)胞內(nèi)域之間建立緊密接觸。這種方法使我們能夠檢測(cè)藥物對(duì)人源心肌細(xì)胞動(dòng)作電位形狀的影響。結(jié)合激光穿孔的3DFG電極可用于全碳細(xì)胞內(nèi)微電極陣列，以監(jiān)測(cè)細(xì)胞的電生理狀態(tài)。

一、介紹

監(jiān)測(cè)神經(jīng)元和心肌細(xì)胞的電活動(dòng)對(duì)于研究大腦和心臟的電生理學(xué)、探究神經(jīng)退行性疾病或心臟疾病以及開發(fā)新的治療策略具有根本的重要性。微電極陣列（MEA）平臺(tái)因其能夠通過同時(shí)測(cè)量數(shù)百/數(shù)千個(gè)細(xì)胞的電信號(hào)來監(jiān)測(cè)大量細(xì)胞群而被廣泛使用。特別是在體外應(yīng)用中，由于最近采用了新型二維（2D）和三維金屬電極配置，MEA方法在準(zhǔn)確性與高通量之間提供了理想的平衡，這使得能夠記錄類似細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位（AP）的信號(hào)。

石墨烯的非凡特性，如生物相容性、高電導(dǎo)率和柔韌性，使其成為開發(fā)用于研究可興奮細(xì)胞電生理學(xué)的微電極陣列和晶體管的絕佳候選材料。然而，迄今為止，基于石墨烯的設(shè)備僅限于細(xì)胞外場(chǎng)電位（FP）記錄，這無法像膜片鉗技術(shù)那樣捕捉到動(dòng)作電位的主要特征。這極大地限制了石墨烯微電極在體外電生理學(xué)中的應(yīng)用，因?yàn)闇?zhǔn)確監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位的能力是毒理學(xué)研究和藥物篩選試驗(yàn)的一項(xiàng)基本要求。

利用納米材料（如多孔鉑）在水中通過光能產(chǎn)生高能載流子（熱載流子）已被證明能夠以非常局部且非侵入性的方式穿孔細(xì)胞膜。在石墨烯基材料中，光照射已被證實(shí)能夠產(chǎn)生熱載流子。因此，激光刺激基于石墨烯的微電極陣列可能會(huì)導(dǎo)致局部細(xì)胞膜穿孔（光穿孔），從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)記錄。此外，增加石墨烯基電極的可用表面積有望在激光照射時(shí)產(chǎn)生更高程度的熱載流子，從而降低穿孔細(xì)胞所需的激光強(qiáng)度。我們近期報(bào)道了一種高比表面積的石墨烯基納米結(jié)構(gòu)：三維毛狀石墨烯（3DFG）。3DFG的形態(tài)使其成為實(shí)現(xiàn)可興奮細(xì)胞光穿孔以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)電活動(dòng)記錄的理想候選材料。

在此，我們展示了利用3DFG多電極陣列（MEA）通過光穿孔進(jìn)行心肌細(xì)胞動(dòng)作電位（AP）的細(xì)胞內(nèi)記錄。在近紅外（NIR）波段用超快脈沖激光照射時(shí)，3DFG電極中產(chǎn)生的熱載流子使細(xì)胞膜得以光穿孔。光穿孔與3DFG的高有效表面積相結(jié)合，能夠以高信噪比（SNR）記錄動(dòng)作電位，從而能夠識(shí)別各種藥物對(duì)心肌細(xì)胞離子電流的影響。通過心肌細(xì)胞-3DFG電極界面的橫截面掃描電子顯微鏡（SEM）成像觀察到，石墨烯薄片的垂直形態(tài)進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜與3DFG電極緊密貼合。這項(xiàng)工作將推動(dòng)開發(fā)出柔韌、低成本且生物相容的全碳MEA平臺(tái)，用于細(xì)胞內(nèi)電活動(dòng)記錄。此外，在近紅外二區(qū)（1000至1700納米）中石墨烯的低功函數(shù)可能使細(xì)胞穿孔在較厚的組織和類器官中的應(yīng)用成為可能，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮t外二區(qū)的吸收和散射較少。

二、結(jié)果與討論

01.掃描電子顯微鏡、光學(xué)和光電特性表征

通過等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積（PECVD）按照先前報(bào)道的程序合成了3DFG。通過調(diào)整合成參數(shù)，例如合成時(shí)間，我們可以定制出平面外石墨烯薄片的尺寸和密度。按照標(biāo)準(zhǔn)的微納加工工藝制造了功能性3DFG微電極陣列（MEA）（圖S1；有關(guān)3DFG制造的詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱材料與方法）。在MEA制造過程中，3DFG的平面外形態(tài)得以保留，從而形成了高表面積的微電極（圖1A和圖S2；有關(guān)3DFG MEA的結(jié)構(gòu)和電化學(xué)特性的詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱注釋S1和S2）。

圖1三維多孔金柵（3DFG）的掃描電子顯微鏡（SEM）成像和光學(xué)特性表征。（A）5微米3DFG電極的SEM圖像。比例尺：5微米（I）、1微米（II）和0.5微米（III）。（B）熔融石英（灰色）、在800°C下合成10分鐘的3DFG（紅色）和在800°C下合成30分鐘的3DFG（藍(lán)色）的紫外-可見光吸收率隨波長的變化。（C）3DFG在可見光和近紅外范圍內(nèi)的介電常數(shù)的實(shí)部（ε1）和虛部（ε2）。（D）在1064納米超快（皮秒）脈沖激光激發(fā)下，3DFG電極與磷酸鹽緩沖液（PBS）界面產(chǎn)生的光電流，激光強(qiáng)度變化時(shí)的情況。脈沖序列持續(xù)時(shí)間為6毫秒。（E）激光激發(fā)產(chǎn)生的光電流的電容分量和法拉第分量。電容值取激光激發(fā)開始時(shí)的最大電流峰值。法拉第值計(jì)算為激光脈沖序列結(jié)束前最后1毫秒部分的平均值。

增加垂直于平面的石墨烯薄片的尺寸和密度會(huì)導(dǎo)致紫外-可見光（UV-Vis）吸收率上升，這從獲取的UV-Vis光譜（圖1B）中可以看出。增強(qiáng)的吸收可歸因于垂直于平面的石墨烯薄片對(duì)光的捕獲能力增強(qiáng)，因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)類似于納米紋理硅和碳超材料。為了研究3DFG的光學(xué)響應(yīng)類型，我們對(duì)在800°C下合成90分鐘的3DFG薄膜進(jìn)行了表征，薄膜沉積在熔融石英基板上，通過橢圓偏振光譜法提取了材料在可見光和近紅外范圍內(nèi)的介電常數(shù)（介電常數(shù)）的實(shí)部和虛部（圖1C）。介電常數(shù)提供了入射光子與材料相互作用類型的信息。特別是，如果材料具有負(fù)實(shí)介電常數(shù)，并且與具有正實(shí)介電常數(shù)的材料（例如空氣或水）相接，入射光子可以通過激發(fā)表面等離子體激元與之強(qiáng)烈相互作用。我們對(duì)3DFG介電常數(shù)的測(cè)量表明，在300至1700納米范圍內(nèi)，3DFG并未表現(xiàn)出等離子體行為，其介電常數(shù)（ε1）為正值，如圖1C所示。