研究簡介:研究了檳榔堿對PC12細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用，特別關(guān)注了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)源性硫化氫（H2S）生成紊亂在其中的作用。檳榔堿是檳榔中的主要生物堿，已知對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有影響，并與多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿處理的PC12細(xì)胞表現(xiàn)出活力下降、細(xì)胞凋亡增加以及caspase-3活性上調(diào)，這些都是神經(jīng)毒性的標(biāo)志。此外，檳榔堿還增加了促凋亡蛋白Bax的表達，降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同時檳榔堿還引發(fā)了PC12細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為GRP78、CHOP和裂解Caspase-12表達的上調(diào)。檳榔堿處理降低了培養(yǎng)上清液中的H2S水平以及β半胱氨酸合成酶和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶的表達，這兩種酶是PC12細(xì)胞中產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的兩種主要酶。這些結(jié)果表明檳榔堿誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性可能與細(xì)胞內(nèi)ER應(yīng)激和內(nèi)源性H2S生成紊亂有關(guān)，這為未來治療檳榔堿引起的神經(jīng)毒性提供了潛在的干預(yù)靶點。研究結(jié)果強調(diào)了調(diào)節(jié)細(xì)胞ER應(yīng)激和內(nèi)源性H2S生成可能是治療檳榔堿導(dǎo)致的神經(jīng)毒性的潛在療法。

Unisense微呼吸系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微電極微呼吸系統(tǒng)應(yīng)用于測量PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的硫化氫（H2S）含量測定。使用Unisense 硫化氫電極（型號H2SMRCh，Unisense）和配套的皮安培放大器，測定了經(jīng)檳榔堿處理后PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的H2S濃度。首先對unisene硫化氫微電極進行預(yù)極化，直到其顯示穩(wěn)定信號至少10分鐘。然后將1mL的培養(yǎng)上清液注入微呼吸瓶中，并記錄電信號。

實驗結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿對PC12細(xì)胞具有神經(jīng)毒性作用，這表現(xiàn)為細(xì)胞活力的顯著下降、細(xì)胞凋亡的增加以及caspase-3活性的上調(diào)。檳榔堿處理的PC12細(xì)胞中，促凋亡蛋白Bax的表達增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達降低，這表明檳榔堿可能通過影響線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。檳榔堿誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78、CHOP和裂解caspase-12的表達增加，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在檳榔堿引起的神經(jīng)毒性中可能發(fā)揮了作用。檳榔堿處理降低了PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的H2S含量，并且減少了β半胱氨酸合成酶(CBS)和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-MST)的表達，這兩種酶是產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的主要酶。研究結(jié)果表明，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)源性H2S生成可能是治療檳榔堿誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的潛在療法。

圖1、檳榔堿對PC12細(xì)胞活力的影響。PC12細(xì)胞經(jīng)0.1、0.5、1和2mM的檳榔堿處理24小時后，用CCK-8檢測法測定細(xì)胞活力。數(shù)值與對照組的平均值(100%)進行歸一化，以平均值±S.E.M.表示，n=3。

圖2、檳榔堿對PC12細(xì)胞凋亡的影響。PC12細(xì)胞分別用0.5、1和2mM的檳榔堿處理24小時。A，熒光顯微鏡(200×)顯示了用Hoechst 33258染色的PC12細(xì)胞的核形態(tài)。細(xì)胞核發(fā)出明亮熒光并破碎的細(xì)胞代表凋亡細(xì)胞。B，caspase-3活性通過Elisa進行評估，每個實驗條件下獲得的caspase-3活性水平以對照的倍數(shù)計算。C，凋亡細(xì)胞的百分比通過annexinV-FITC/PI染色進行量化。數(shù)據(jù)為三個獨立實驗的代表性圖像，數(shù)值為平均值±SEM，*P<0.05；**P<0.01，與對照組相比。

圖3、檳榔堿對PC12細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達的影響。用抗Bax抗體和抗Bcl-2抗體分別對PC12細(xì)胞中Bax(a)和Bcl-2(b)蛋白的表達進行免疫印跡檢測。在所有印跡中，β-actin均用作負(fù)載對照。數(shù)據(jù)為三個獨立實驗的代表性圖像，數(shù)值為平均值±SEM，*P<0.05；**P<0.01；與對照組相比。

圖4、檳榔堿對PC12細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。PC12細(xì)胞經(jīng)0.5、1和2mM的檳榔堿處理24小時后，用Western印跡法測定葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)(a)、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)同源蛋白(CHOP)(b)和裂解的caspase-12蛋白(c)的表達。在所有印跡中，β-actin均用作負(fù)載對照。

圖5、檳榔堿對PC12細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的影響。a如“材料與方法”一節(jié)所述，用單義硫化氫微電極檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中H2S的含量。PC12細(xì)胞中CBS蛋白(b)和3-MST蛋白(c)的表達量通過Western印跡法測定。Western印跡圖像顯示了三個獨立實驗的代表性結(jié)果。在所有印跡中，β-actin均用作負(fù)載對照。

結(jié)論與展望

檳榔堿是檳榔的一種主要生物堿，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有影響。雖然有報道稱檳榔堿會誘發(fā)神經(jīng)中毒，但其潛在的神經(jīng)中毒機制尚未闡明。越來越多的證據(jù)表明，過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激和硫化氫(H2S)生成紊亂參與了多種神經(jīng)退行性疾病的病理生理學(xué)過程。本研究旨在驗證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)源性硫化氫(H2S)生成紊亂是否也參與了檳榔堿引起的神經(jīng)毒性。使用Unisense H2S微呼吸電極，研究人員能夠精確地測定經(jīng)檳榔堿處理后PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的H2S濃度。這對于評估檳榔堿對內(nèi)源性H2S生成的影響至關(guān)重要，這些數(shù)據(jù)支持了檳榔堿通過干擾內(nèi)源性H2S生成而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的假設(shè)。研究發(fā)現(xiàn)用檳榔堿處理PC12細(xì)胞會導(dǎo)致細(xì)胞活力下調(diào)、細(xì)胞凋亡和caspase-3活性上調(diào)，這表明檳榔堿對PC12細(xì)胞具有神經(jīng)毒性作用。此外檳榔堿還增加了PC12細(xì)胞中Bax(促凋亡蛋白)的表達，降低了Bcl-2(抗凋亡蛋白)的表達。同時檳榔堿還導(dǎo)致PC12細(xì)胞ER應(yīng)激反應(yīng)過度，表現(xiàn)為葡萄糖調(diào)控蛋白78(GRP78)、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)和裂解Caspase-12表達的上調(diào)。值得注意的是，培養(yǎng)上清液中的H2S水平以及β半胱氨酸合成酶和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(PC12細(xì)胞中產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的兩種主要酶)的表達量也因檳榔堿處理而降低。這些結(jié)果表明，檳榔堿導(dǎo)致的PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性與細(xì)胞ER應(yīng)激和內(nèi)源性H2S生成紊亂有關(guān)，并表明調(diào)節(jié)細(xì)胞ER應(yīng)激和內(nèi)源性H2S生成可能是治療檳榔堿導(dǎo)致的神經(jīng)毒性的潛在療法。