熱線：021-56056830,66110819
手機：13564362870
4活體電化學抗蛋白質吸附
腦是一個復雜的系統(tǒng)，不僅有神經細胞、膠質細胞、小分子，還有生物大分子等，如蛋白質。在活體伏安法分析中，當微電極被植入到活體腦組織中時，電極會引發(fā)一系列的排異反應，從而影響電極的電化學分析性能。首先，在電極植入到活體的短時間內，蛋白質會非特異性吸附到電極表面，從而使電極的靈敏度迅速下降，響應時間變長。其次，在蛋白質吸附之后的幾天內，中性粒細胞的吸附占據(jù)主導地位，在24～48 h后，中性粒細胞逐漸消失，并被單核細胞及巨噬細胞取代，最終在電極周圍形成由巨噬細胞和膠原蛋白組成的無血管纖維囊（50～200μm），以致使物質的傳輸和電子轉移受阻，最終導致電極靈敏度下降，甚至使電極失去響應。因此，避免蛋白質在電極表面的非特異性吸附（即抗生物污染），同時提高微電極的電化學性能對活體電化學的研究至關重要。
蛋白質吸附導致的一個結果是微電極必須在植入活體后進行校正，通常認為電極在植入到腦內一段時間后蛋白質吸附會達到穩(wěn)定，所以選擇在活體實驗后進行電極校正，進而分析活體檢測信號。但，活體后校正方法仍存在一些問題。首先，活體分析中使用的碳纖維電極比較脆，從腦中取出時很容易折斷而無法進行后校正實驗。其次，后校正方法的提出是基于在整個實驗過程中電極的靈敏度保持不變，這就要求我們的電極在植入活體后，蛋白質能夠迅速吸附并達到平衡。但，腦內蛋白質環(huán)境復雜，且蛋白質濃度在不同的生理和病理環(huán)境下可能發(fā)生變化。如干擾素和血小板衍生生長因子等在疾病中濃度會發(fā)生變化，這使得后校正方法對獲取比較真實的活體檢測信號存在一些偏差。
為了解決蛋白質吸附所造成的活體微電極的校準問題，研究人員提出了一些新的策略。Roberts等基于快速掃描伏安法（FSCV）建立了電極的原位校正方法，該方法借助電極背景中的非法拉第電流等參數(shù)建立模型，通過理論預測對電極進行校正。但該方法僅局限于FSCV，并且影響模型參數(shù)的因素較多，不同的實驗室在使用時均需要重新測量參數(shù)?？刮鄄牧闲揎楇姌O表面以減小蛋白質的非特異性吸附是解決電極靈敏度降低、活體后需要再次校正的另一策略。目前，Nafion，堿處理的醋酸纖維，PEDOT/Nafion等材料在一定程度上可減少蛋白質的非特異性吸附。Singh等系統(tǒng)的研究了Nafion、醋酸纖維、牽連蛋白修飾碳纖維電極（CFE）對單胺類遞質檢測結果的影響。他們發(fā)現(xiàn)不同材料修飾電極對電極的靈敏度、選擇性及抗污染性能的影響也不同。有些材料有助于提高電極的選擇性和靈敏度（如Nafion），有些材料則能提高電極的抗污染性能（如醋酸纖維、牽連蛋白）。雖然這些材料可通過控制厚度來提高電極的抗污染性能，但電極在活體實驗后靈敏度仍然有較大的變化，仍需對電極進行活體后的校正。
為了克服微電極必須在活體后校準的缺點，Liu等提出了用BSA處理微電極的方法進行活體原位分析，因他們發(fā)現(xiàn)微電極在BSA溶液中，電極的靈敏度會迅速降低，但BSA的濃度大于30 mg/mL時，電極的靈敏度不再下降，即使電極在與BSA電荷相反的蛋白質溶液中，電流響應也很穩(wěn)定?；诖?，他們在活體檢測前用40 mg/mL BSA處理微電極，結果表明，活體前校準曲線的靈敏度和活體后校準曲線的靈敏度一致。并且，用BSA處理檢測多巴胺（DA）的CFE和檢測抗壞血酸（AA）的碳納米管修飾CFE，發(fā)現(xiàn)這兩種電極在活體前和活體后的校準曲線都是一致的，這說明了BSA處理的方法具有很好的普適性。該方法為活體電化學方法提供了可靠且簡單的電極前校準的策略（圖6）。
在提高微電極的抗蛋白吸附能力的同時保持微電極的靈敏度對活體檢測極其重要，Liu等進一步設計了聚合物單體EDOT PC（兩性離子磷酸膽堿官能化的乙烯二氧噻吩），并通過電化學聚合法將其可控地聚合在微電極表面，形成了具有類細胞膜結構的PEDOT PC超薄膜。其中由于PC端的電化學聚合自限制，形成了非常薄的PEDOT PC膜，保證了待檢測物在膜內的快速傳質。因此，PEDOT PC修飾的微電極不僅能夠有效地抗蛋白質的非特異性吸附，而且能保持電極的檢測靈敏度。利用PEDOT PC修飾的CFE準確監(jiān)測了大鼠腦內KCl刺激，以及電刺激過程中DA的釋放。該研究有效解決了微電極在活體原位分析中蛋白質吸附的關鍵問題，為更好地研究腦神經化學的分子機制奠定了重要基礎（圖7）。
在微電極的表面構筑特殊結構也是有效克服蛋白質吸附造成分析性能下降的有效途徑。Zhou等在CFE表面構筑了一個高孔隙率的、有序的二氧化硅抗污染薄膜（SNM）。SNM能夠有效地防止蛋白質進入到通道中引起CFE電極表面的生物污染，同時對O2的擴散具有高滲透性?；铙w實驗表明：SNM/CFE可連續(xù)監(jiān)測O2且能夠保持對其高的分析靈敏度和快速響應。為了能夠在構筑多孔結構的同時又具有高的親水性能，F(xiàn)eng等報道了一種聚單寧酸（PTA）摻雜的納米多孔導電聚苯胺（PANI）膜涂層，其中PANI構筑了多孔的結構，PTA的摻雜不僅使得PANI在中性溶液中保持了導電能力，而且PTA的多羥基使得構筑的PTA PANI多孔膜親水性能更強，并對DA具有很強的富集能力。所制備的PTA PANI修飾的CFE表現(xiàn)出高的抗蛋白吸附的能力，活體前和活體后DA的校準曲線靈敏度基本一致，并且活體檢測DA的釋放具有高的穩(wěn)定性（圖8）。
在電化學分析中，蛋白質吸附對不同信號輸出方式的影響不同，因此所使用的抗蛋白質吸附的方法也不同。Hao等發(fā)展了一種具有高抗蛋白質吸附性能的電位型傳感器可用于直接監(jiān)測鼠腦中pH的變化。該電極通過使用H+選擇性膜（H+ISM）和含有增塑劑雙（2乙基己基）癸二酸酯，H+離子載體三癸胺和離子交換劑鉀四（4氯苯基）的聚氯乙烯聚合物基質制備。體外和體內研究均表明，CF H+ISEs電極具有很強的抗蛋白質吸附性能，CF H+ISE能夠在活體檢測后保持和活體前相同的靈敏度和可逆性（圖9）。
此外，使用紅細胞膜修飾Ag/AgCl設計的參比電極也表現(xiàn)出優(yōu)異的抗蛋白質吸附的性能，在活體內能提供穩(wěn)定的電位并減小對組織的損傷。
5結論
在活體電化學分析中，微電極抗蛋白質吸附層的設計對提高活體檢測結果的準確度，以及正確理解大腦功能的分子機制，都具有十分重要的意義。雖然在宏觀電極上，目前有很多抗污染的方法可實現(xiàn)抗蛋白質的吸附，并能實現(xiàn)部分復雜樣品，如血液等中的物質的分析，活體內通過電極界面設計也實現(xiàn)了部分物質的短時間實時分析，但活體分析抗蛋白質的吸附仍然存在很大的挑戰(zhàn)。這主要是因為：（1）在宏觀電極上可實現(xiàn)的策略，很難在微電極上實現(xiàn)，如表面微結構的調控，表面修飾等，因微電極表面需要更苛刻的合成條件和原位可控修飾技術;（2）抗蛋白質吸附策略物質依賴性強，不同信號讀出方式，信號轉換方式的抗蛋白質吸附策略也不一樣，需依據(jù)不同信號讀出方式（如電流法、電位法、電阻法等）和不同轉換方式（如酶、適配體等）設計不同的抗蛋白質吸附的策略;（3）活體長期檢測需要抗蛋白質膜具有更高的生物相容性和化學穩(wěn)定性。相信，隨著各學科的發(fā)展，如材料科學、微納制備技術、信號轉換和讀出模式等，能更好地解決微電極的蛋白質吸附的問題，實現(xiàn)腦內化學物質的準確分析，更好地揭示腦神經科學的化學本質。
