內(nèi)容提要：目的：驗證MED64系統(tǒng)記錄小鼠海馬腦片自發(fā)放電方法可行性，以及觀察平面微電極陣列技術應用于抑郁，帕金森，癲癇等研究的優(yōu)勢。方法：通過MED64系統(tǒng)對正常以及由低鎂高鉀加4-AP誘導的小鼠海馬腦片進行記錄，運用Mobius軟件進行數(shù)據(jù)分析。結果：正常ACSF灌注記錄到成年小鼠海馬腦片神經(jīng)元自發(fā)放電改用4-AP+低鎂高鉀ACSF灌注8min左右后小鼠海馬腦片呈現(xiàn)癲癇樣放電。換回正常ACSF洗脫30min后腦片放電恢復正常，癲癇樣放電逐漸消失。結論：MED64平面微電極陣列技術可以記錄小鼠海馬腦片神經(jīng)元自發(fā)放電，運用該技術成功建立了小鼠海馬腦片癲癇模型。

微電極陣列（Multi-Electrode Array）記錄系統(tǒng)是包括了離體電生理研究所需的一整套硬件設備耗材和分析軟件。自從第一套微電極陣列系統(tǒng)問世后，它主要是通過如何取得更好的胞外記錄信號和增加電極的密度數(shù)量上這兩方面來發(fā)展的。本校中心試驗室的MED64平面微電極陣列是日本Alpha MED Sciences公司研發(fā)的多通道離體電生理記錄系統(tǒng)。它可通過64個平面微電極對離體組織或細胞進行多通道電生理同步記錄。適用于神經(jīng)、視網(wǎng)膜和心肌細胞電生理特性和離子通道生物學特性研究。由于同時記錄腦片多個神經(jīng)元或可興奮組織的放電，采集數(shù)據(jù)多，大大地擴展了研究的視野，有助于對整個神經(jīng)核團或器官的神經(jīng)元之間聯(lián)系和功能的研究。并且由于平面微電極陣列技術對于細胞來說是無創(chuàng)性的，這樣既保持了對單細胞的準確記錄，又能記錄對藥物刺激響應的較長時間的演變。這些特點使得其具有不可替代的優(yōu)勢。

目前本校已有多個神經(jīng)生物學、生理學PI組對記錄分析活體組織神經(jīng)元自發(fā)性活動有迫切需求，尤其是癲癇病研究領域。這就需要建立一套平面微電極陣列記錄離體神經(jīng)組織自發(fā)放電的方法。

1.材料與方法

1.1一般材料

實驗動物：選取清潔級健康成年雄性C57BL/6小鼠，由首都醫(yī)科大學動物部提供，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0011。實驗動物的使用均按照首都醫(yī)科大學實驗動物中心和北京實驗動物協(xié)會的標準執(zhí)行。整個實驗過程中盡可能地減少對動物的傷害及所用動物的數(shù)量。

試劑：4-氨基吡啶（4-Aminopyridine，4-AP）購自Sigma公司，其余試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2方法

海馬腦片的制備：將小鼠斷頭，迅速剝離出全腦置于冰水混合態(tài)的標準人工腦脊液（Artificial Cerebrospinal Fluid，ACSF）中靜置1min。ACSF的組成（mmol/L）：NaCl 117，KCl 3.6NaH2PO4·2H2O 1.2，MgCl2·6H2O 1.2，CaCl2·2H2O2.5，NaHCO325，D-Glucose 11，pH 7.3～7.4。然后取出鼠腦剝離出海馬組織至于修好的瓊脂凹槽中，用濾紙吸出多余液體后切掉后端小部組織，而后用502膠將海馬組織與瓊脂凹槽固定于組織振動切片機（日本Dosaka，DTK1000）浴槽的金屬底板上，切取400μm厚的海馬腦片（以冠狀面切片）。將切好的腦片移至ACSF的孵育槽中，ACSF預先通以95%O2和5%CO2混合氣至氧飽和。室溫下孵育1h后記錄。記錄時持續(xù)灌流氧飽和的ACSF，流速控制在3～4mL/min。

1.3 MED64平面微電極陣列的預準備

本實驗電生理記錄所采用的MED64 Probe（MED64平面微電極陣列探針，日本Alpha Med Sciences）是在透明石英玻璃（50mm×50mm×1.1mm，Pyrex7059）中心內(nèi)嵌一個裝配有64個（8×8等距陣列）平面微電極的電路板構成（圖1a）[6]。MED64 Probe中心每個平面微電極的面積是50μm×50μm，間距為150μm（P515A型號）（圖1b）。實驗中根據(jù)組織標本大小，面積的不同可以選擇其適合的電極規(guī)格型號。電極使用前需要用含0.1%的聚氮丙啶（Polyethylenimine，PEI）硫化物的硼酸鹽緩沖液包埋處理（12h以上），目的是加強電極表面對腦片組織的黏著親和性。

圖1.MED64平面微電極陣列探針（a.MED64Probe；b.8×8等距微電極陣列；c.海馬腦片在電極陣列上的位置）

1.4記錄海馬腦片自發(fā)放電

用寬口吸管將孵育好的海馬腦片移入MED64 Probe。在倒置顯微鏡下先用尼龍蓋網(wǎng)蓋住腦片，然后用鑷子夾住尼龍網(wǎng)將腦片拖至電極陣列記錄位置后蓋上金屬壓片（SHD-22L，美國Harvard）將其固定。用蠕動泵（BT100-2J，LongPump）持續(xù)灌流通入95%O2和5%CO2混合氣的ACSF（灌流速度3～4mL/min，室溫）。灌流過程中用CCD顯微照相機（DP70，日本Olympus）采集海馬腦片-MED64電極位置圖像（圖1c）并且排除系統(tǒng)噪聲干擾，將噪聲控制在±10μV以下。灌流20min后使用Mobius軟件對海馬腦片神經(jīng)元的自發(fā)電活動信號進行同步采樣，采樣率為20kHz[7]。得到正常自發(fā)放電數(shù)據(jù)后改用4-AP+低鎂高鉀ACSF灌流，以形成癲癇樣放電的海馬腦片（癲癇樣放電達到10次/min以上）。記錄10min后換回正常ACSF洗脫直至癲癇樣放電消失。

2.結果

2.1正常小鼠海馬腦片自發(fā)放電

正常ACSF灌流時，MED64 Probe64個通道中僅有個別通道可以觀察到海馬腦片少量神經(jīng)元自發(fā)放電（圖2a-1）。通過Mobius軟件對放電信號通道分析可以提取出不同放電特征的多個神經(jīng)元（圖2a-2）。

圖2.小鼠海馬腦片放電（a-1.MED64記錄正常小鼠海馬腦片自發(fā)放電；a-2.第29通道海馬腦片神經(jīng)元自發(fā)放電；b-1.MED64記錄4AP+無鎂高鉀ACSF誘導的海馬腦片自發(fā)性癲癇樣放電；b-2.第27通道海馬腦片神經(jīng)元癲癇樣放電）

2.2小鼠海馬腦片癲癇樣放電

灌流4-AP+低鎂高鉀ACSF大約8min左右（（500±50）s，n=6）海馬腦片神經(jīng)元開始出現(xiàn)簇狀密集的癲癇樣放電（圖2b-1）。在出現(xiàn)相對大的癲癇樣放電事件之前會先觀察到一些通道的神經(jīng)元由靜默轉為興奮，先出現(xiàn)一定數(shù)量的自發(fā)放電，然后出現(xiàn)相對幅度較小間期較長的癲癇樣放電。癲癇樣放電的區(qū)域包括海馬（Cornu Ammonis，CA）部分區(qū)域和齒狀回（Dentate Gyrus，DG）部分區(qū)域，神經(jīng)元放電幅值在20～120μV（圖2b-2）。記錄10min后換回正常ACSF洗脫，癲癇樣放電隨之逐漸減弱30min后完全消失。

3.討論

現(xiàn)在神經(jīng)科學研究的主要目標就是研究功能性的神經(jīng)回路在生理和病理情況下的區(qū)別，而單個神經(jīng)元是構成神經(jīng)回路的基礎。神經(jīng)元的自發(fā)電活動是大腦神經(jīng)回路編碼機制和信息處理機制研究的基礎，產(chǎn)生這些自發(fā)電活動的生理信號是分布在大腦空間的，并且往往按照某些規(guī)則分布在大腦的。神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展往往表現(xiàn)為自發(fā)電活動等生理信號的異常，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的時候往往不是一個神經(jīng)元的自發(fā)電活動發(fā)生了變化，而是很多甚至整個核團的自發(fā)電活動和規(guī)律發(fā)生了變化，比如說抑郁、癲癇、帕金森、阿爾茨海默等疾病。所以同時對自發(fā)電活動的空間分布的多通道記錄是很重要的。

目前對于神經(jīng)元電活動的研究方法主要有細胞內(nèi)和細胞外玻璃電極記錄，微電極陣列技術，光遺傳學等。細胞內(nèi)和細胞外玻璃電極記錄是目前最常用的，但只能記錄單細胞的放電，不適于研究多個神經(jīng)元的電活動，而且它對于細胞來是有創(chuàng)的，只能用于短時間記錄。光遺傳學主要應用對電壓或鈣敏感的染料來觀察細胞的活動，只能看很淺層的神經(jīng)元（由于入射光只能穿透很淺的一層組織），還有性噪比的問題，這些都限制了它的應用。另外還有比如功能性核磁共振、腦電圖、腦皮層電圖，但這些方法空間分辨率不夠，看不到單個神經(jīng)元電活動的變化。要揭示神經(jīng)系統(tǒng)處理信息的復雜機制，必須獲得足夠數(shù)目的神經(jīng)細胞的電活動信息。近些年隨著電子技術和微機械加工技術的快速發(fā)展，微電極陣列技術也隨之得到了巨大提升。目前該技術可以同時檢測幾十甚至上百個通道的電信號，實現(xiàn)了對神經(jīng)網(wǎng)絡的高空間分辨率檢測。因此，MED64平面微電極陣列系統(tǒng)對研究神經(jīng)組織網(wǎng)絡特性有著很大的技術優(yōu)勢。

微電極陣列技術近年來多用于培養(yǎng)神經(jīng)元及神經(jīng)組織的電生理記錄。急性腦片的記錄也多為記錄興奮性突觸后場電位（Field Excitatory Postsynaptic Potential，fEPSP）。急性腦片自發(fā)放電記錄少有報道。本實驗使用平面微電極陣列技術記錄到成年小鼠海馬腦片神經(jīng)元自發(fā)放電并且成功建立4-AP+低鎂高鉀ACSF誘導的急性小鼠海馬腦片癲癇模型。通過實驗完善優(yōu)化了MED64系統(tǒng)記錄離體腦片自發(fā)放電的方法，拓展了該設備功能。為記錄分析活體組織神經(jīng)元自發(fā)性放電活動的研究提供相應的技術保障。為學校研究癲癇、帕金森、抑郁、阿爾茨海默病等重大腦疾病提供科學研究平臺。