研究簡介:腫瘤微環(huán)境的酸度從根本上影響癌癥和基質(zhì)細(xì)胞的功能、它們的相互作用以及形成惡性進(jìn)展的選擇壓力和適應(yīng)過程。腫瘤微環(huán)境的酸堿組成對預(yù)后預(yù)測和新治療方法的開發(fā)具有相當(dāng)大的前景，但我們?nèi)匀蝗狈侠碓O(shè)計(jì)靶向干預(yù)措施的機(jī)制洞察力。CA9還具有至少部分獨(dú)立于其碳酸酐酶活性的促癌作用，涉及細(xì)胞粘附功能，并且可能受到細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域脫落的影響。盡管CA9和CA12是乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物和擬議的藥理學(xué)靶點(diǎn)，但這些和其他碳酸酐酶對特定乳腺癌分子亞型的影響仍不清楚。在代謝和增殖活性、免疫原性和潛在致癌途徑不同的腫瘤中，碳酸酐酶如何影響癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞（包括脈管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)）之間的相互作用。離體腫瘤脈管系統(tǒng)和免疫細(xì)胞功能的酸堿依賴性變化是顯著的，但它們在腫瘤微環(huán)境中的后果需要進(jìn)一步研究。實(shí)體癌組織內(nèi)明顯的擴(kuò)散限制——結(jié)合碳酸酐酶活性的局灶性積累和pH介導(dǎo)的酸堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白變構(gòu)調(diào)節(jié)—導(dǎo)致從根本上影響腫瘤生物學(xué)的分隔pH動(dòng)力學(xué)。因此為了解決碳酸酐酶在致癌和癌癥進(jìn)展過程中的功能貢獻(xiàn)，在體內(nèi)或在保持逼真的3維結(jié)構(gòu)和相關(guān)基質(zhì)成分的離體條件下研究癌組織至關(guān)重要。在這里研究人員通過以下方式實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)：研究從人類和小鼠乳腺癌組織和匹配的正常乳腺組織中新鮮分離的類器官中碳酸酐酶的表達(dá)和功能；在小鼠乳腺癌模型中的體內(nèi)研究，以及評估與臨床和病理信息相結(jié)合的人體體積和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

Unisense微電極分析系統(tǒng)的應(yīng)用

首先向荷瘤小鼠腹膜內(nèi)注射50 mg/kg乙酰唑胺或載體來評估體內(nèi)急性碳酸酐酶抑制的pH值后果。然后5分鐘后，小鼠注射氯胺酮和甲苯噻嗪以誘導(dǎo)麻醉。老鼠被放在加熱墊上；總共30分鐘后，通過一個(gè)小切口暴露腫瘤，并使用玻璃微電極（pH-500；Unisense，丹麥），以記錄進(jìn)入腫瘤的1毫米步進(jìn)過程中的pH值。參比電極放置在腹腔內(nèi)。報(bào)告了腹膜表面、腫瘤4毫米深度以及遇到的酸性最強(qiáng)的腫瘤位置（表示為腫瘤“核心”）的pH值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

碳酸酐酶——尤其是細(xì)胞外亞型CA4、CA6、CA9、CA12和CA14——在人類和小鼠乳腺癌發(fā)生過程中發(fā)生了強(qiáng)烈的表達(dá)變化。在基底樣/三陰性乳腺癌患者中，細(xì)胞外碳酸酐酶表達(dá)升高對生存有負(fù)面預(yù)測，而令人驚訝的是，細(xì)胞外碳酸酐酶對HER2/ErbB2富集乳腺癌患者的生存有積極預(yù)測。碳酸酐酶抑制減弱細(xì)胞凈酸排出和細(xì)胞外H+從人和小鼠乳腺癌組織的擴(kuò)散受限區(qū)域到外周和灌注良好區(qū)域的消除。在體內(nèi)提供的碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺可酸化ErbB2誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌微環(huán)境，限制腫瘤免疫浸潤（CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞），降低炎性細(xì)胞因子（Il1a、Il1b、Il6)和轉(zhuǎn)錄因子(Nfkb1)表達(dá)，并加速腫瘤生長。支持碳酸酐酶的免疫調(diào)節(jié)作用，與富含HER2的乳腺癌細(xì)胞外碳酸酐酶高表達(dá)相關(guān)的患者生存獲益取決于腫瘤炎癥特征。乙酰唑胺可降低乳腺組織和血液中的乳酸水平而不影響乳腺腫瘤灌注，這表明抑制碳酸酐酶可降低發(fā)酵糖酵解。碳酸酐酶通過加速癌細(xì)胞和間質(zhì)間隙的凈H+消除來提高乳腺癌中的pH值，在ErbB2/her2驅(qū)動(dòng)的乳腺癌中提高免疫浸潤和炎癥，限制腫瘤生長并提高患者生存率。

圖1、在人類乳腺癌組織中，線粒體CA5A和CA5B在細(xì)胞類型中普遍表達(dá)，而非線粒體碳酸酐酶亞型在癌癥上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中占主導(dǎo)地位，除了CA7僅由癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞和骨髓細(xì)胞表達(dá)。A)總體碳酸酐酶表達(dá)強(qiáng)度顯示為t-SNE圖（左）和相應(yīng)的成簇細(xì)胞類型（右）。B)圖顯示了人乳腺癌中碳酸酐酶表達(dá)的細(xì)胞類型特異性模式。報(bào)告的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)涵蓋24489個(gè)癌上皮細(xì)胞、6573個(gè)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞、7605個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞、35214個(gè)T細(xì)胞、3206個(gè)B細(xì)胞和9675個(gè)髓樣細(xì)胞。數(shù)據(jù)是從Broad Institute托管的在線單細(xì)胞門戶中提取的。C圖顯示了294個(gè)乳腺癌樣本中碳酸酐酶的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

圖2、具有已知細(xì)胞外表達(dá)的碳酸酐酶亞型CA4、CA6、CA12和CA14、具有已知線粒體表達(dá)的CA5β和具有已知細(xì)胞溶質(zhì)表達(dá)的CA7可積極預(yù)測富含HER2的乳腺癌患者的預(yù)后。A–L富含HER2的乳腺癌患者(n=358–860)的生存曲線根據(jù)每種碳酸酐酶亞型的mRNA表達(dá)進(jìn)行分層。曲線的顏色編碼區(qū)分具有已知細(xì)胞外或分泌（紅色）、細(xì)胞溶質(zhì)（綠色）和線粒體（藍(lán)色）表達(dá)的碳酸酐酶亞型。

圖3、碳酸酐酶從根本上改變了乳腺癌組織中的pH動(dòng)力學(xué)，抑制了癌細(xì)胞的凈酸排出，并降低了從核心到外周的間質(zhì)凈H+消除。(A)響應(yīng)于將CO2應(yīng)用于不含HEPES緩沖CO2/HCO3的溶液的平均pH曲線；B量化酸化速率。(C)在裝有pH敏感熒光團(tuán)羧基SNARF-1的類器官的赤道平面上獲取的共聚焦圖像。白色描繪說明了用于量化類器官核心和外圍pH動(dòng)力學(xué)的示例性感興趣區(qū)域。DH細(xì)胞外（表面）pH動(dòng)力學(xué)響應(yīng)小鼠ErbB2誘導(dǎo)的急性暴露（D–F）和人類（G+H,)乳腺癌類器官對CO2/HCO3–相對于沒有CO2/HCO3–的初始平均值。圖F顯示了類器官核心和外圍之間的量化pHo差異，以及它們?nèi)绾伪籆O2/HCO3和碳酸酐酶抑制修飾。圖H顯示了關(guān)于類器官核心和實(shí)驗(yàn)之間pHo差異的類似信息。IN響應(yīng)小鼠ErbB2誘導(dǎo)的急性暴露的細(xì)胞內(nèi)pH動(dòng)力學(xué)（I–K，n=6–26）和人類（L-N,n=8)乳腺癌類器官對CO2/HCO3–相對于沒有CO2/HCO3–的初始平均值。

圖4、細(xì)胞內(nèi)碳酸酐酶的抑制降低了小鼠ErbB2誘導(dǎo)的乳腺癌組織中細(xì)胞凈酸擠出的能力。A在NH 4+前脈沖誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)酸化和隨后的恢復(fù)過程中，新鮮分離的乳腺癌類器官中pH i的平均曲線(n=6)。使用乙酰唑胺（ATZ，100μM）、4-氨基乙基）苯磺酰胺（AMB，30μM）或等量的DMSO載體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。面板的右側(cè)部分顯示放大的細(xì)胞內(nèi)酸化恢復(fù)階段。B凈酸擠出繪制為類器官外圍和核心區(qū)域pHi的函數(shù)從ErbB2誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌組織中新鮮分離(n=6)。C在最大酸化過程中對應(yīng)于初始pHi恢復(fù)階段的固定pH i計(jì)算的凈酸擠出(n=6)。

圖5、用乙酰唑胺進(jìn)行體內(nèi)治療可酸化小鼠ErbB2誘導(dǎo)的乳腺癌組織的微環(huán)境，降低乳酸濃度，并加速腫瘤生長。A）使用pH敏感微電極(n=8)進(jìn)行的體內(nèi)pH測量。“核心”被定義為在用電極逐步刺穿期間遇到的酸性最強(qiáng)的區(qū)域。在記錄前30分鐘，小鼠已接受腹膜內(nèi)注射50 mg/kg乙酰唑胺(ATZ)或同等體積的載體。通過重復(fù)測量雙向方差分析比較數(shù)據(jù)。B）示例性事后剖析腫瘤圖像和體內(nèi)ErbB2誘導(dǎo)的乳腺癌生長曲線，小鼠每天腹腔注射40 mg/kg ATZ與接受等體積載體的小鼠(n=17)相比。將數(shù)據(jù)擬合為二階多項(xiàng)式函數(shù)，并通過額外的平方和F檢驗(yàn)比較最佳擬合參數(shù)。比例尺代表5mm；兩個(gè)圖像都以相同的放大倍數(shù)顯示。C-H）通過微透析評估的腫瘤糖酵解代謝。在ATZ或載體給藥開始后1小時(shí)測量間質(zhì)或血清[乳酸](C–E)和[葡萄糖](F–H)。

結(jié)論與展望

碳酸酐酶催化CO2/HCO3–緩沖反應(yīng)，對有效的H+流動(dòng)性、pH動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞酸堿感應(yīng)有影響。然而碳酸酐酶對癌癥和基質(zhì)細(xì)胞功能、它們的相互作用和患者預(yù)后的綜合影響尚不清楚。研究人員將人類蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析以及大量和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)與臨床病理學(xué)和預(yù)后信息相結(jié)合，使用了unisense微電極系統(tǒng)的pH敏感微電極記錄和基于微透析的代謝物分析，用于實(shí)驗(yàn)性誘發(fā)乳腺癌的小鼠腫瘤內(nèi)的pH分布。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的疾病?；谑荏w表達(dá)譜（例如，HER2/ErbB2、雌激素、黃體酮）的分層識別在潛在致癌機(jī)制和惡性行為中具有重疊特征的分子亞型。因此，這種分類為揭示疾病機(jī)制和闡明乳腺癌患者亞群之間可能存在差異的治療結(jié)果提供了重要工具。本研究證明了碳酸酐酶有助于清除乳腺癌組織中的酸性代謝物，并且它們的抑制作用會(huì)增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的酸度。在小鼠ErbB2誘導(dǎo)的和人類HER2富集的乳腺癌中，細(xì)胞外碳酸酐酶增加免疫細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子表達(dá)，減緩腫瘤生長，并提高存活率。